栀子黄色素的精制及栀子蓝色素的转化

景艳艳，李世杰，陈茂彬，蒋 威，方尚玲

（教育部发酵工程重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉430068）

栀子果是茜草科植物栀子的果实，含有两种色素：栀子苷（京尼平苷）和类胡萝卜素类的栀子黄色素（藏花素）。栀子黄色素精制过程洗脱的废液中含有栀子苷。研究表明：栀子苷在β－葡萄糖苷酶或β－半乳糖苷酶的作用下，可与伯氨基酸（α－氨基酸）发生聚合反应，生成蓝色色素[1］。近几年来，用于生产β－葡萄糖苷酶的菌株多为黑曲霉、木霉等霉菌属，杆菌属的菌株较少。作者从土壤及菌种保藏室中筛选到4株霉菌、2株杆菌，并利用它们将栀子黄色素精制废液（栀子黄废液）转化为栀子蓝色素，变废为宝，以充分循环利用栀子资源。

1 实验

1.1 材料、菌株与培养基

栀子果，市售。

苏云金芽孢杆菌BT、苏云金芽孢杆菌BT－140、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌BT－7216、嗜热脂肪杆菌和枯草芽孢杆菌，分别编号1＃～7＃，湖北工业大学菌种保藏室。

杆菌斜面培养基[2］：葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，NaNO30.3%，琼脂2%，pH 值7.0。

杆菌种子培养基[2］：葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，NaNO30.3%，pH 值7.0。

杆菌发酵培养基：麸皮2%（麸皮加水煮沸后经4层纱布过滤得到的滤液），蛋白胨2%，栀子黄废液10%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，pH 值7.0。

初筛培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，栀子黄废液10%。

平板分离培养基：栀子黄废液10%，谷氨酸钠0.1%，蛋白胨0.5%，KH2PO41%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂2%。

PDA培养基：土豆20g，葡萄糖2g，琼脂2g，水100mL，115℃灭菌30min。

霉菌种子培养基：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO40.2%。

霉菌发酵培养基：麸皮2%（麸皮加水煮沸后经4层纱布过滤得到的滤液），蛋白胨2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，栀子黄废液10%。

1.2 方法

1.2.1 栀子黄色素的提取

准确称取经粉碎机粉碎后的栀子果粉末15g，加入150mL水，60℃水浴30min，过滤，得1次提取液；滤渣加100mL水再次浸提，过滤，得2次提取液；滤渣加50mL水第3次浸提，过滤，得3次提取液。将3次提取液混合，备用。

1.2.2 栀子黄色素的精制

1.2.2.1 树脂的预处理

AB－8型大孔吸附树脂经除杂、80%乙醇浸泡24h充分溶胀后，用80%乙醇洗至洗出液加等体积水无浑浊现象，再用去离子水洗至无醇味。

1.2.2.2 树脂的吸附和解吸

称取1g预处理后的AB－8型大孔吸附树脂于250mL锥形瓶中，加入50mL栀子黄色素提取液，于30℃、150r·min－1摇床振荡过夜至吸附平衡，测吸附前后色素溶液在440nm（栀子黄色素的最大吸收波长）处的吸光度值。

称取吸附平衡的AB－8型大孔吸附树脂0.5g，加25mL 60%乙醇，于30 ℃、150r·min－1摇床振荡24h，测解吸后60%乙醇中栀子黄色素在440nm处的吸光度值。按下式计算吸附率和解吸率：

式中：A1为吸附前栀子黄色素提取液在440nm处的吸光度值；A2为吸附平衡后栀子黄色素提取液在440nm处的吸光度值；A3为解吸后60%乙醇中栀子黄色素在440nm处的吸光度值。

1.2.2.3 栀子黄色素的精制

取吸附平衡的AB－8型大孔吸附树脂，装柱。依次用去离子水（4BV）、20%乙醇（5BV）、60%乙醇（6.5BV）进行洗脱，流速为1.5mL·min－1。收集60%乙醇的洗脱液，经浓缩干燥得栀子黄色素精品。剩余的洗脱液即为含大量栀子苷的栀子黄废液，再经浓缩去醇，置于－20℃冰箱保存备用。

1.2.3 栀子蓝色素转化菌的筛选

1.2.3.1 土壤中目的菌株的筛选

初筛：称取1g土样加入20mL无菌水充分振荡制成悬液。吸取1mL土样悬液于装有50mL初筛培养基的250mL摇瓶中，于30℃、180r·min－1摇床培养2d。若摇瓶培养过程中发现摇瓶内发酵液变蓝，说明含有目的菌株。

平板分离：取初筛培养基中的菌液作梯度稀释。取不同稀释梯度的菌悬液0.2mL涂布在平板分离培养基于30℃PHX型智能生化培养箱中培养观察。挑取能在平板分离培养基上产生蓝色菌圈的菌株划线分离，得到单菌落。

复筛：挑取单菌落接种到初筛培养基中，于30℃、180r·min－1摇床培养2～3d，发酵液转蓝的摇瓶对应的菌株即为目的菌株，将其接种到PDA培养基上作菌种斜面保藏。

1.2.3.2 杆菌的筛选

分别挑取5环斜面活化后的杆菌于种子液中，于35℃、180r·min－1摇床培养10h，以10%接种量接种到杆菌发酵培养基中摇床培养24h，发酵液转蓝所对应的菌株即为目的菌株。

1.2.4 目的菌株转蓝发酵培养

将筛选得到的目的菌株进行转蓝发酵培养：4株从土壤中筛选得到的目的菌株在种子培养基中培养3d再转接到发酵培养基于30℃摇床培养5d，转蓝发酵液稀释10倍；苏云金芽孢杆菌BT－7216和枯草芽孢杆菌在种子培养基中培养10h后以10%接种量接种到发酵培养基中培养24h，平行实验3次，转蓝发酵液稀释3倍。

取上述发酵液以10 000r·min－1离心10min，取上清液检测590nm处吸光度值。以去离子水为对照。

按下式计算发酵液色价（E1%1cm）：

式中：OD590为吸光度值；f为稀释倍数；V为发酵液总体积的1%，mL。

2 结果与讨论

2.1 AB－8型大孔吸附树脂的吸附、解吸效果

实验发现，AB－8型大孔吸附树脂对栀子黄色素的吸附率达到88.92%、解吸率达到95.38%，吸附率和解吸率都较高，可用于栀子黄色素的精制。

2.2 栀子黄色素精制前后吸收光谱分析（图1）

图1 栀子黄色素提取液（a）、栀子黄废液（b）、栀子黄色素精制品（c）的吸收光谱Fig.1 The absorption spectra of gardenia yellow pigment extract（a），gardenia yellow waste（b）and purified gardenia yellow pigment（c）

由图1可知，栀子黄色素提取液的吸收光谱中，峰1在440nm处，为藏花素和藏花酸的特征吸收峰，栀子黄色素是一种罕见的水溶性类胡萝卜素，主要成分是类胡萝卜素类的α－藏花素和藏花酸[3］；峰2为杂质峰；峰3在325nm附近，为绿原酸的特征吸收峰；峰4在238nm处，为栀子苷的特征吸收峰。栀子黄废液的吸收光谱中，栀子苷的含量很高，已经超出了最大测量值，说明栀子黄废液可以作为栀子蓝色素微生物转化的原料。栀子黄色素精制品的吸收光谱中，栀子苷的吸收峰不明显，由此可见栀子黄色素精制后栀子苷的含量明显减少；同时325nm处的吸光度与440nm处的吸光度比值由2.32下降到1.16，说明精制过程中除去了大量绿原酸。

2.3 转蓝发酵液吸收光谱分析

土壤中目的菌株的初筛培养液以及杆菌筛选发酵液都有蓝色色素，为确定该色素是否为栀子蓝色素，对转蓝发酵液进行吸收光谱扫描，见图2。

图2 转蓝发酵液的吸收光谱Fig.2 The absorption spectrum of the fermentation broth for converting blue

由图2可知，590nm处有一吸收峰，这与栀子蓝色素的最大吸收波长为590nm相一致[4］，可确定栀子黄废液经微生物发酵转化为了栀子蓝色素。

2.4 杆菌的筛选

7株杆菌中有6株发酵液有颜色变化，测定其580～600nm处吸光度值，发现6株杆菌转蓝发酵液的吸收峰值都在590nm附近。7株杆菌发酵转蓝情况比较见表1 。

表1 7株杆菌发酵转蓝比较Tab.1 Comparison of the fermentation for converting blue of the seven Bacillus strains

由表1 可知，7株杆菌的转蓝发酵液稀释3倍后吸光度值较大的是苏云金芽孢杆菌BT－7216和枯草芽孢杆菌，同时两者发酵液的颜色呈蓝色，色泽较好。因此，选择苏云金芽孢杆菌BT－7216和枯草芽孢杆菌进一步驯化比较。

2.5 栀子黄废液转蓝发酵

从土壤中筛选得到4株目的菌株，分别编号1＃～4＃，其菌落形态见图3。

图3 4株目的菌株的形态Fig.3 Morphology of the four object strains

由图3可知，4株目的菌株属于霉菌属。

4株霉菌、2株杆菌转蓝发酵液的吸光度值和色价见表2 。

表2 4株霉菌、2株杆菌转蓝发酵液的吸光度值和色价Tab.2 The absorbance values and color values of fermentation broth of the four molds and the two Bacillus strains

由表2 可知，从土壤中筛选得到的4株霉菌在栀子黄废液转蓝发酵过程中效果较突出的是2＃和4＃菌株，发酵液经稀释10倍后吸光度值分别达0.258、0.343，色价（590nm）分别为129.0、171.5；枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌BT－7216转蓝发酵液稀释3倍后，吸光度值分别达0.326、0.260，色价（590nm）分别为48.9、39.0，其中枯草芽孢杆菌的转蓝效果较好。

2.6 讨论

（1）在培养过程中，目的菌株可分解培养基中的蛋白胨为氨基酸，同时分泌出β－葡萄糖苷酶，在β－葡萄糖苷酶作用下将栀子黄废液转化为栀子蓝色素。

（2）本研究的色价计算为发酵液的色价，而通常是将发酵液换算成色素粉末来计算色价，那样其色价将更高。

3 结论

（1）栀子黄色素提取液经AB－8大孔吸附树脂吸附，装柱后依次经去离子水、20%乙醇、60%乙醇动态洗脱，除去大量杂质得到高纯度的栀子黄色素，栀子黄色素精制后的废液中含有大量的栀子苷，可用于栀子蓝色素的微生物转化。

（2）经初筛、复筛、转蓝发酵培养，从土壤中筛选得到4株霉菌，其中2＃和4＃菌株为优势菌株，转蓝发酵液稀释10倍后590nm处吸光度值分别达到0.258、0.343，发酵液色价 E1%1cm（590nm）分别为 129.0、171.5，达到了国际市场标准。

（3）从菌种保藏室中的7株杆菌中筛选到转蓝效果较好的2株杆菌，其中枯草芽孢杆菌的转蓝效果更好，转蓝发酵液稀释3倍后590nm处吸光度值为0.326，发酵液色价E1%1cm（590nm）为48.9。与霉菌相比，杆菌的转蓝发酵液色价较低，但用杆菌转蓝发酵周期短、效率高，其应用潜力很大，可对其转蓝发酵工艺进行优化，提高转蓝效率。

[1]赵垦田.植物精深产品加工工艺学[M］.哈尔滨：东北林业大学出版社，2007：63.

[2]方尚玲，刘源才，张庆华，等.细菌产β－葡萄糖苷酶发酵优化[J］.化学与生物工程，2007，24（9）：54－58.

[3]李炜.栀子果化学成分的综合应用研究[D］.北京：北京林业大学，2006.

[4]杨志，张芳，李梅，等.栀子蓝色素制备及纯化工艺的研究[J］.现代食品科技，2008，24（4）：352－356.