外源水杨酸对重金属Pb毒害迷迭香挥发物释放的缓解效应

求红波，王 丹，周示玉，高建荣，李祖光

（浙江工业大学 化学工程与材料学院，浙江 杭州310032）

近年来，随着现代工业化的快速发展，环境污染在日益加重，重金属污染对生态系统造成了重大的影响.铅（Pb），镉（Cd），铜（Cu），铬（Cr），镍（Ni）等重金属对植物的生理生化，遗传，代谢途径等产生毒害作用，影响植物挥发性代谢产物的释放.水杨酸（Salicylic Acid，SA）是植物体内普遍存在的一种植物激素，它作为植物内源信号分子，参与植物的多种抗性反应，因此被广泛应用于外源胁迫和刺激等逆境生理的研究［1－2］.JOZEF K 等［3］研究了 Cu和 SA对绿藻植物中酚类代谢物及自由氨基酸变化的影响.DONG Juane等［4］研究表明：SA 诱导使鼠尾草植物体内酚类化合物积累增加，提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL），酪氨酸氨基转移酶（TAT），超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）以及过氧化物酶（POD）的活性.BELKHADI A 等［5］研究表明：SA可以降低Cd对亚麻植物的毒害，使其体内的亚麻酸和棕榈酸含量增加.另外，Pb，Ni，Cd，Hg胁迫对植物次生代谢途径的改变具有明显影响［6－8］.赵菲佚等［9］研究表明：Cd和Pb复合处理使植物叶片中叶绿素含量下降，脯氨酸含量升高，乙烯释放量增加.迷迭香（RosmarinusofficinalisL.）系唇形科迷迭香属植物，具有提神醒脑，增强记忆，抗氧化等作用，广泛应用于医药、食品、天然香料等领域.目前仅局限于对迷迭香挥发油成分的分析与研究［10－12］，尚未见外源水杨酸对重金属毒害迷迭香挥发物释放缓解效应的研究报道.采用重金属Pb，SA以及Pb与SA的混合物（SA＋Pb）胁迫处理迷迭香，利用简单，快捷，无溶剂的顶空固相微萃取－气相色谱－质谱（HS－SPME－GC－MS）联用技术，探讨重金属 Pb对迷迭香植物挥发物释放的影响及SA对Pb毒害迷迭香挥发物释放的缓解效应，为重金属Pb污染毒害植物的生态防御研究提供科学依据.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

迷迭香购于浙江杭州钱江花鸟市场；水杨酸，分析纯（AR），上海化学试剂采购供应五联化工厂；氯化铅（PbCl2），分析纯（AR），上海试四赫维化工有限公司；气相色谱－质谱（GC－MS）联用仪（CP3800－Saturn 2000），配有液体化学源（色谱级乙腈为化学电离反应试剂），美国Varian公司制造；手动固相微萃取进样器（US.Supelco公司）；65μm聚二甲基硅氧烷／二乙烯基苯（PDMS／DVB）萃取纤维头（US.Supelco公司），在进行样品吸附前，对固相微萃取纤维按说明书要求进行老化；25mL顶端带聚四氟乙烯隔垫密封圈的样品顶空瓶（US.Supelco公司）；分析天平，规格 Max210g，d＝0.1mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司.

1.2 实验条件

色谱条件：毛细管柱为 DB－5low bleed／MS，30m×0.25mm×0.25μm（J＆W Scientific，CA，USA）；进样口温度为250℃；载气为 He，纯度为99.999%，流速为0.8mL／min；柱温为40℃保持5min，3℃／min升温至250℃并保持5min；分流比为1∶30.

质谱条件：离子源为EI或CI，EI的电子能量为70eV，采样时间为2～80min；离子阱温度为150℃；歧管温度为40℃；质量扫描范围为40～650m／z；GC－MS传输线温度为280℃；扫描速度为3scans／s.

1.3 样品处理

用喷水器分别对迷迭香植株均匀喷施30mL的各种诱导溶液，保证植株每片叶片喷施量相同，并对其进行标记.其中，A盆植株作为对照（CK）喷二次去离子水，B盆植株喷SA溶液（5mmol／L），C盆植株喷Pb溶液（0.01mol／L），D盆植株喷SA＋Pb溶液SA（5mmol／L）＋Pb（0.01mol／L）.经诱导溶液处理24h后，分别取迷迭香顶部枝丫叶片0.2g，在室温下（25±5）℃于25mL顶空瓶中SPME平衡吸附60min后，立即进行GC－MS分析，解析温度为250℃，解析时间为5min.

1.4 定性与定量分析

首先以EI为电离源，进行GC－MS分析，采集所得到的总离子流图中各质谱图利用NIST及WILEY两个谱库串联检索；然后用液体乙腈为化学源，进行GC－MS分析，根据产生的准分子离子峰（M＋1）等进一步确定待测化合物的分子量.同时采用保留指数（RI）定性的方法来辅助质谱检索定性，质谱检索与保留指数相结合的二维定性方法是一种可信度较高的定性方法.用于测量保留指数的正构烷烃系列标准样品为C6－C18，定量分析结果是依据总离子流色谱峰的峰面积归一化法计算各组分的相对含量.

2 结果与讨论

2.1 迷迭香挥发物成分的测定

利用含65μm聚二甲基硅氧烷／二乙烯基苯（PDMS／DVB）纤维头的HS－SPME萃取对照组（CK）迷迭香挥发物后对其进行GC－MS分析，通过谱库检索和人工解析，其定性定量结果见表1，总离子流色谱图见图1.

图1 HS－SPME－GC－MS测定迷迭香挥发物的总离子流图Fig.1 TIC of the volatile compounds fromRosmarinus officinalis L.by HS－SPME－GC－MS

从迷迭香中共鉴定出41种化合物，主要挥发物为马鞭草烯酮（17.00%），龙脑（11.90%），桉树脑（9.05%），乙酸冰片酯（7.81%），β－石竹烯（5.27%），α－萜品醇（4.75%），顺式－β－萜品醇（4.50%），樟脑（4.42%），莰烯（3.85%），反式－香叶醇（2.84%），菊油环酮 （2.80%），4－萜品醇（2.60%），α－柠檬烯（2.56%），4－（2－甲氧基苯基）－2－丁酮（2.15%），甲酸异冰片酯（1.68%），萜品油烯（1.57%），（3E）－3－乙酸己烯酯（1.42%），反式－乙酸香芹酯（1.08%），α－水芹烯（1.06%）等；其中萜烯类挥发物的质量分数为17.32%，酯类为13.25%，酮类为27.09%，醇类为38.79%，其他挥发物为3.55%.

表1 迷迭香挥发物成分的GC－MS鉴定结果1）Table 1 The Identify results of volatile compounds fromRosmarinus officinalis L.by GC－MS

续表1

2.2 Pb，SA以及SA＋Pb对迷迭香挥发物释放的影响

将浓度为0.01mol／L 的 Pb溶液，5mmol／L的SA溶液以及Pb与水杨酸的混合溶液SA（5mmol／L）＋Pb（0.01mol／L）用于处理迷迭香叶片，对照组（CK）喷水处理.取处理24h后的迷迭香进行GC－MS分析，其总离子流色谱图见图2，Pb，SA，SA＋Pb处理对迷迭香各类挥发物释放的影响结果见图3.

图2 GC－MS分析Pb，SA和SA＋Pb处理后的迷迭香挥发物的总离子流图Fig.2 TIC of volatile compounds fromRosmarinus officinalis L.under Pb，SA and SA＋Pb stress by GC－MS

由图3可知：SA，Pb，SA＋Pb处理使迷迭香中萜类、酯类、酮类、以及醇类挥发物的释放均发生变化.SA处理使萜烯类、酯类挥发物的释放增加，质量分数分别增加4.00%和7.80%，分别是对照组的1.23和1.59倍；而SA处理使酮类、醇类挥发物的释放减少，质量分数分别降低3.99%和7.13%.Pb处理抑制萜烯类、酯类挥发物的释放，质量分数分别降低1.10%和2.34%；但却使酮类、醇类挥发物的释放增加，质量分数分别增加1.72%和1.73%，是对照组的1.06和1.04倍.SA＋Pb处理使迷迭香挥发物中萜烯类、酯类的释放增加，而使酮类、醇类挥发物的释放减少，萜烯类、酯类挥发物的质量分数分别增加3.08%和1.72%，是对照组的1.18和1.13倍；酮类、醇类挥发物的质量分数降低2.11%和2.60%.

图3 Pb，SA和SA＋Pb对迷迭香挥发物释放的影响Fig.3 Effect on volalite compounds fromRosmarinus officinalis L.under Pb，SA and SA＋Pb stress

重金属Pb在植物体内积累会对植物产生毒害作用，从而影响植物的生长发育、代谢途径的变化，进而影响植物挥发物的释放.对迷迭香植物来说，重金属Pb的毒害抑制了萜烯类、酯类挥发物的释放，促进了酮类、醇类挥发物的释放；SA处理使迷迭香植物中萜烯类、酯类挥发物释放增加，酮类、醇类挥发物释放减少；然而在Pb和SA共同作用下（SA＋Pb），SA是植物体内的一种信号分子，参与植物代谢途径中的各种分子调控和抗性调节，而最终降低了重金属Pb对迷迭香植物的毒害，使其萜烯类、酯类挥发物释放增加，酮类、醇类挥发物释放减少.由图3可以明显的看到，在SA＋Pb处理下，萜烯类、酯类挥发物释放的含量高于对照，但介于Pb处理和SA处理之间；相反，酮类、醇类挥发物释放的含量低于对照，也介于Pb处理和SA处理之间.总之，在SA的参与调节下，萜烯类、酯类、酮类、醇类挥发物的释放恰好与Pb单独处理时相反，而比SA单独处理时释放有所减弱.可见，SA的参与对重金属Pb毒害植物起到了明显的减轻或缓解作用，但SA是如何减轻或缓解重金属Pb的毒害作用机理还需做进一步的研究.

3 结 论

利用简单，快捷，无溶剂的顶空固相微萃取－气相色谱－质谱（HS－SPME－GC－MS）联用技术从迷迭香中共测定了41种挥发性化合物，主要成分为萜烯类（17.32%），酯类（13.25%），酮类（27.09%）和醇类（38.79%）.SA作为植物体内的一种信号分子，能激活多种与胁迫反应有关的基因启动子，诱导逆境相关蛋白的合成，能通过调节活性氧、抗氧化酶及非酶促抗氧化体系而提高植物抗逆性.研究结果表明：SA对重金属Pb胁迫下的迷迭香植物挥发物释放具有明显的减轻或缓解效用，这为重金属毒害植物的生态防御研究提供科学依据.

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