抗烟草花叶病毒病药用植物筛选及提取物复配增效研究

刘宏松 ，陈丽鹃 ，周冀衡

（1.湖南农业大学烟草研究院，湖南 长沙 410128；2.昆明市官渡区烟草公司，云南 昆明 650200）

烟草普通花叶病主要是由烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）引起的，烟草花叶病毒是披盖病毒科烟草花叶病毒属的单链RNA（ssRNA）病毒，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和苋科等36个科350多种植物，有寄主范围广、抗逆性强、生产危害大等特点[1]。感染了烟草花叶病的烟叶，烤晒后色泽不均，品质及等级均不同程度地下降[2]，是烟叶生产可持续发展中亟待解决的关键问题之一[3-4]。由于植物没有完整的免疫代谢系统，而烟草花叶病毒在植物细胞中属于绝对寄生，其复制所需的能量、物质和场所完全依赖于寄主，因此烟草花叶病毒病的防治较困难，对烟叶生产来说是一种巨大的威胁。目前，烟草花叶病毒病已上升为威胁中国烟叶生产的主要病害之一，我国南北烟区常有加大规模的病情发生，尤其以南方烟区受害较重[5]。据报道，全世界每年仅由于TMV造成的经济损失就超过1亿美元[6]。

当前，烟叶生产中烟草花叶病最常用的防治方法有选择抗病品种、培育无毒壮苗、施用抗病毒制剂、采用农业保健栽培措施和生物防治等。然而，烟草品种具有较明显的区域适应性，同一品种在不同地区种植其抗病特性也有差异；同时，农业栽培防治措施也仅仅起到有限的预防作用，其精细的栽培过程往往给烟农带来沉重的负担；因此，寻求有效的烟草花叶病毒病防控措施已成为当务之急。

植物资源广泛，且植物是生物活性化合物的天然宝库，植物产生的次生代谢产物超过20万种，其中包含了大量的能有效控制植物病毒病的成分，而生物来源的抗病毒活性物质既环保又无毒副作用，已逐渐成为抗病毒药剂研发的新方向。笔者通过提取50种植物的生物活性物质，来处理感染TMV病毒的烟株，以检测其抑制TMV的生理效应及防治效果，旨在为植物源抗病毒类生物农药的研制提供新的资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 共采集了云南（15种）、贵州（35种）两省共50种植物（表1），经华中农业大学生命科学院植物学教研室鉴定并保存凭证标本。

1.1.2 供试毒源 试验所用烟草花叶病毒由华中农业大学植物病理研究所提供，试验前参照王人元的方法对病毒进行纯化，然后将纯化后的病毒进行紫外扫描，选择呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20）的病毒液进行接种，接种液用PBS缓冲液定容为20 μg/mL。

1.1.3 供试烤烟品种 供试烤烟品种为心叶烟（Nicotiana glutinosa L.），将心叶烟种子与一定量基质混匀后均匀洒在装有基质的育苗盘中，浇水适量，置于适宜条件下（温度22℃，光照16 h/d，湿度60%）培养，当幼苗长至4~6片真叶时进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 植物材料的预处理 （1）将阴干的植物材料置于恒温烘箱内，加温至50℃，干燥后粉碎，过40目筛，放入密封袋中备用。（2）将植物样品用乙酸乙酯进行超声波提取，超声波频率为1 200 Hz，2s/次，工作间歇 0.2 s，全程 30 min，温度 40℃。（3）植物样品质量与溶剂的体积比为1∶8，重复提取两次，共计60 min。（4）将提取液过滤两次，合并滤液进行减压浓缩。（5）用乙酸乙酯将浓缩液定容至20 mL刻度试管中，即1 mL提取物中含有1 g干植物样品的物质，密封后放到0~4℃冰箱中保存。（6）准确吸取5 mL植物乙酸乙酯提取液（1 g/mL），以清水加乳化剂为基质，稀释为5倍液、10倍液、20倍液、50倍液，备用。

表1 供试植物名录

1.2.2 防效测定 （1）TMV体外钝化作用测定。以半叶枯斑法检测植物提取液对TMV的体外钝化作用。具体方法：选取健康生长旺盛的4~6叶期心叶烟左半叶接种植物提取液（50倍液）与病毒的等体积混合液，右半叶接种蒸馏水与病毒的等体积混合液（对照），重复3次。接种5~7 d后计算枯斑数，枯斑抑制率计算公式：枯斑抑制率（%）＝（对照枯斑数－处理枯斑数）/对照枯斑数×100%。（2）对TMV初侵染和复制增殖作用的测定。同样以半叶枯斑法进行检验。具体方法：选取健康生长旺盛的4~6叶期心叶烟，初侵染试验中先在供试植物左半叶涂药，间隔一定时间后，再全叶接种病毒；复制增殖试验中先全叶接种病毒，间隔一定时间后，再在供试植物的左半叶涂药。植物提取液浓度为50倍液，吗啉胍·乙铜浓度为400倍液，病毒接种浓度为10 μg/mL。各处理重复3次，5~7 d后计算枯斑数，按上述方法计算枯斑抑制率。（3）活性植物提取物质之间增效作用的测定方法。采用协同毒力指数法确定两种植物提取液混合使用时是否具备增效作用，计算公式为：混剂理论死亡率（%）=1－（1－Pa）×（1－Pb），式中Pa、Pb分别表示各单剂的枯斑抑制率；协同毒力指数（c.f）=（实际死亡率－理论死亡率）/理论死亡率×100。当协同毒力指数＜-20时，表示两种植物提取液表现为拮杭作用；当协同毒力指数＞20时，表示两种植物提取液表现为增效作用；当协同毒力指数处于-20~20之间时，表示两种植物提取液表现为相加作用。

2 结果与分析

2.1 植物提取物抗TMV的生物活性

采用50种植物提取物对TMV体外钝化生物活性进行了研究，结果见表2。

表2 五十种植物提取物对TMV体外钝化生物活性测定结果

从表2中可以看出，在植物提取物干重浓度为0.1 g/mL的剂量下，50种植物提取物对TMV病毒病均表现出不同程度的抑制活性。其中，乳浆大戟对TMV病毒病的抑制作用最强，枯斑抑制率高达65.66%；其次是甘草（62.12%）；蛇莓植物对TMV病毒病也表现出一定的抑制活性，枯斑抑制率达57.49%；其余47种供试植物样品对TMV病毒病作用较弱，枯斑抑制率均＜50%。

2.2 植物提取物对心烟叶的初浸染和增殖侵染

在供试植物提取物的浓度下，选择对TMV病毒病枯斑抑制率大于50%的3种植物进行了活性复筛，主要研究其对TMV病毒病的初侵染和复制增殖情况，其结果见表3。从表3中可知，3种植物植物提取物对TMV病毒病的体外钝化、初浸染、复制增殖都有明显的抑制效果，且显著高于对照药剂。

2.3 植物提取物两两组合物对心烟叶的初浸染和增殖侵染

表3 甘草、乳浆大戟和蛇莓的植物提取物对TMV病毒病的初侵染和复制增值抑制活性 （%）

对2.2筛选出的甘草、乳浆大戟、蛇莓3种抗TMV活性物质进行复配增效研究，结果（表4）表明：甘草＋蛇莓组合表现为增效作用；甘草＋乳浆大戟组合表现为相加作用；蛇莓+乳浆大戟组合表现为拮抗作用。

表4 不同植物提取物组合抗TMV的协同毒力指数

3 讨论

植物作为可直接开发利用的自然资源，目前正面临着两大危机：（1）野生植物资源的种类和产量呈逐年下降趋势；（2）随着药用植物资源需求量的不断增加，导致一些重要的药用植物资源常年超量采挖。因此，植物天然活性物质的生产和自然资源保护之间的矛盾日益突出。为了更好地开发和利用这些具有较高农用活性的植物，如何利用生物工程、基因工程等手段解决高农用活性资源紧缺问题的研究势在必行。

该研究对50种植物提取物抗TMV活性的检测不可避免的存在漏筛现象，即使在试验中对TMV无明显抑制效果的植物，有可能因为试验方法的缺陷或其他原因而没有检测出其真实活性，对于这些在初筛过程中很难避免的问题，应在以后的研究过程中高度重视。此外，关于该研究筛选出的“甘草＋蛇莓”组合的最佳增效比，以及各成分的增效机理仍有待深入研究。

[1]翟梅枝，高芳銮，沈建国，等.抗TMV植物的筛选及提取条件对抗病毒物质活性的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2004，32（7）：45-49.

[2]朱贤朝，王彦亭，王智发.中国烟草病害[M].北京：中国农业出版社.2002.

[3]赖荣泉，赖碧添，黄光伟，等.烟草病虫害预警防灾体系的构建及其应用[C].北京：中国农业科学技术出版社，2007：808-810.

[4]上官克攀，林祥永，曾文龙，等.闽西烟区主要病害及其综合防治技术体系[J].中国烟草科学，2006，27（1）：20-23.

[5]吴艳兵，颜振敏，谢荔岩，等.天然抗烟草花叶病毒大分子物质研究进展[J].微生物学通报，2008，35（7）：1096-1101.

[6]吴云峰.生物病毒农药筛选及其应用[J].世界农业，1995，（5）：35-36.