康肤霜对糖尿病大鼠烫伤创面愈合的作用＊

龚震宇，童亚林△，万友华，杨润生，苏晓玲

（中国人民解放军第181医院：1.烧伤整形科；2.病理科；3.动物实验中心，广西桂林541002）

烧伤患者合并糖尿病在临床中较常见，这类患者的创面愈合较困难，常发展成经久不愈的溃疡，极大地影响了临床治疗效果［1］。康肤霜为烧伤创面外用药物，动物实验证实其对急、慢性创面的愈合具有明显促进作用［2－4］。本实验在已建立的新型糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面模型的基础上，观察康肤霜对该模型创面愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级 Wistar雄性大鼠24只，体质量（220±25）g，由桂林医学院动物中心提供（合格证号：SCXK桂2007－0001）。本实验经解放军第181医院动物实验伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂及药物 重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）凝胶购自桂林华诺威基因药业有限公司（批号：20060601）；聚维酮碘为长沙雨花消毒药有限公司产品（批号：20070727／59）；四氧嘧啶为美国Sigma公司产品（批号：GA－14908）；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）链霉亲和素－生物素－过氧化物酶复合物（streptavidin biotin－peroxidase complex，SABC）免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司（克隆编号PC10）。康肤霜为锌、冰片、洗必泰、水溶性基质、少量维生素A及维生素E按一定比例配制的水包油型白色霜剂，由解放军第181医院自行研制。

1.1.3 仪器 主要仪器包括：One Touch血糖仪（美国强生公司）、Olympus BX51型光学显微镜（日本Olympus公司）、DP－70图像分析系统（日本Olympus公司）、自动控时调压烫伤仪（解放军第181医院研制，发明专利号200610114104.4）。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 实验前大鼠禁食12h，测血糖，选取空腹血糖低于7.0mmol／L的大鼠，尾静脉注射四氧嘧啶溶液（40mg／kg），注射后自由饮食，1周后测随机血糖，若血糖超过11.1mmol／L，持续4周，并伴有体质量减轻，多饮、多食、多尿，即可认为建模成功［5］。

1.2.2 糖尿病大鼠烫伤模型的建立［6］取成功建模的糖尿病大鼠24只，采用10%硫化钠水溶液于大鼠背部脱毛，24h后确认脱毛区无损伤。采用1%戊巴比妥钠（30mg／kg）大鼠腹腔注射，麻醉成功后，在大鼠背部脊柱两侧标出4个直径为1.5cm的圆形区域（左、右侧各2个，前后创面相距4cm）。采用自动控时调压烫伤仪致伤，设定高压锅内压力为300mmHg（0.04kPa），温度为106℃，烫伤时间为2s，致伤后创面皮肤颜色呈灰白，质地均匀一致，病理组织学检查证实为深Ⅱ度。

1.2.3 实验分组 致伤后，将大鼠的4个创面随机分为康肤霜组、rhEGF组、聚维酮碘组及生理盐水组，致伤后分别采用康肤霜、rhEGF、聚维酮碘及生理盐水外敷，药物完全覆盖创面，用无菌纱布覆盖、包扎，胶布固定，每日换药1次至创面愈合。实验期间单笼、正常喂养。

1.2.4 实验观察 （1）创面大体观察。每日换药时肉眼观察创面情况，包括：创面水肿渗出程度、是否干燥、有无分泌物及创周红肿变化等，如发现创面有异常分泌物，需进行分泌物细菌培养。（2）创面愈合时间。观察创面上皮完全愈合所需时间，由2位实验人员分别判定并记录。（3）创面愈合率。烫伤后第7、14、21天用数码相机对伤口进行照相，采用Image Pro Plus（IPP）V6.0图像分析软件计算创面愈合面积。按照公式计算创面愈合率［7］：创面愈合率＝（原始创面面积－当前创面面积）／原始创面面积×100%。（4）病理学及组织学观察。烫伤后第7、14、21天各处死6只大鼠，取创面组织行4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色，光镜下观察创面组织炎症细胞浸润、新生血管形成以及肉芽组织与再上皮化变化的情况。（5）PCNA检测。采用SABC试剂盒，染色步骤按试剂盒说明书进行，以磷酸盐缓冲溶液代替第一抗体作为阴性对照，二氨基联苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）显色，细胞核呈棕色者为阳性。采用计数PCNA 标 记指数（labeling index，LI）方法［8］，在400倍光镜下观察染色结果，每组选取6个视野，每个视野均观察100个细胞，计算阳性细胞数，即为标记指数。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量数据用±s表示，创面愈合时间差异用单向方差分析；创面愈合率差异用重复测量方差分析；PCNA标记指数数据用析因分析，采用最小显著差数法（the least significant difference，LSD）进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 创面大体观察 烫伤后见创面呈灰白色，创面中心与周边色泽均匀、质地一致，与周围正常组织界限明显。换药后1～4d，rhEGF组及生理盐水组创面肿胀、渗出最为明显，聚维酮碘组次之，康肤霜组最轻。随着换药时间延长，创面逐渐好转至完全愈合，4组创面均未出现明显脓性分泌物，细菌培养均为阴性，见图1～3。

图1 烫伤时各组创面大体观察

图2 烫伤后第3天各组创面大体观察

图3 烫伤后第21天各组创面大体观察

2.2 创面愈合时间 4组大鼠创面愈合时间由长到短分别为：生理盐水组［（26.37±1.0）d］、聚维酮碘组［（23.83±0.75）d］、rhEGF组［（22.33±1.03）d］及康肤霜组［（20.67±1.03）d］。4组大鼠创面愈合时间两两比较，差异有统计学意义（F＝36.86，P＜0.05）。

2.3 创面愈合率 烫伤后第7、14、21天创面愈合率统计结果显示：康肤霜组大鼠创面的愈合率高于其余3组，4组大鼠创面愈合率两两比较，差异有统计学意义（F＝1239.09，P＜0.05）。各组创面愈合率随时间推移明显升高（P＜0.05），3个时间点的大鼠创面愈合率两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 病理学及组织学观察 烫伤后第7天康肤霜组光镜下可见真皮乳头层充血、水肿不明显，炎症细胞浸润及坏死组织较其他3组少。烫伤后第14天康肤霜组创面的毛细血管数、毛细血管内皮细胞数及成纤维细胞数较其他3组多，肉芽组织生长也更旺盛。烫伤后第21天康肤霜组创面上皮化较完全，新生上皮细胞分化较好，新生上皮组织较厚，有较多的表皮钉脚深入真皮层，而其他3组新生上皮组织较薄，未见有表皮钉脚形成。见图4。

表1 烫伤后不同时间各组创面愈合率的比较±s，%，n＝6）

表1 烫伤后不同时间各组创面愈合率的比较±s，%，n＝6）

组别烫伤后时间（d）7 14 21生理盐水组10.83±1.12 43.76±0.70 75.43±0.89聚维酮碘组 16.12±0.40 48.81±0.76 78.65±0.45 rhEGF组 19.80±1.09 61.73±0.79 89.25±0.98康肤霜组20.83±0.78 64.63±1.54 96.37±1.34

图4 烫伤后第7、14、21天生理盐水组与康肤霜组创面组织的光镜观察（HE×100）

图5 烫伤后第7、14、21天生理盐水组与康肤霜组创面组织的PCNA阳性表达（SABC×100）

表2 烫伤后不同时间各组PCNA标记指数比较±s，%，n＝6）

表2 烫伤后不同时间各组PCNA标记指数比较±s，%，n＝6）

组别烫伤后时间（d）7 14 21生理盐水组14.67±1.86 36.83±2.48 42.17±2.14聚维酮碘组 17.33±1.37 40.83±1.17 46.50±1.87 rhEGF组 28.50±1.05 73.33±2.16 63.33±2.34康肤霜组32.83±1.47 76.33±2.00 67.67±2.94

2.5 PCNA在创面组织中的表达 烫伤后第7、14天4组大鼠创面组织的PCNA主要表达于腺体、毛囊上皮细胞及血管内皮细胞；烫伤后第21天4组大鼠创面组织的PCNA主要表达于新生上皮的基底细胞、基底层以上的部分表皮细胞、腺体和毛囊的上皮细胞及血管内皮细胞。4组大鼠烫伤后第14、21天创面组织均可见少量成纤维细胞PCNA的阳性表达，见图5。康肤霜组PCNA标记指数高于其他3组，4组大鼠创面组织的PCNA标记指数两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。标记指数随时间推移明显升高（F＝2 174.78，P＜0.05）；第14、21天与第7天比较差异有统计学意义（P＜0.05），第14天与第21天比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3 讨 论

实验先采用尾静脉注射四氧嘧啶法建立糖尿病大鼠模型，烫伤后4周大鼠一直维持较高的血糖水平，不同的时间点血糖无明显波动。在此糖尿病大鼠模型上，采用自行研制的自动控时调压烫伤仪建立深Ⅱ度烫伤创面大鼠模型，大体及病理结果证实该模型创面烫伤深度均匀、界限清楚，是一种较理想的糖尿病烫伤创面动物模型。

实验结果显示，与其他3组比较，康肤霜组糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面的愈合速度最快，创面愈合时间最短，创面愈合率最高，表明康肤霜能促进烫伤创面愈合。病理组织学显示康肤霜能明显减轻烫伤创面早期的炎症反应。rhEGF是促进上皮细胞生长的重要因子之一，动物实验及临床试验显示其具有加速糖尿病创面愈合的作用［9－10］。本实验表明康肤霜促进创面愈合的作用优于rhEGF。PCNA是增殖细胞核内DNA聚合酶δ（DNApolymeraseδ，polδ）的一种辅助因子，与真核细胞S期的DNA的复制有关［11］，是反映细胞增殖状态的一个重要指标［12－14］。皮肤组织中的PCNA主要定位于表皮基底层细胞、毛囊上皮细胞、内皮细胞和部分成纤维细胞的细胞核内，在皮肤组织的发生与修复过程中表达增强。实验结果显示康肤霜组PCNA标记指数高于其他3组，说明康肤霜对创面组织细胞的增殖有明显的促进作用，能加快创面再上皮化，促进创面愈合。

糖尿病创面愈合困难主要与2个环节有关：（1）合成分泌胶原的组织细胞功能异常；（2）调控细胞外基质的生长因子及其他调控因子的功能异常。在创面愈合过程中，这些涉及不同环节的功能异常相互作用，构成了创面愈合困难的基础［15］。康肤霜是由锌、冰片、洗必泰、水溶性基质、少量维生素A及维生素E按一定比例配制成的水包油型白色霜剂。维生素A可促胶原蛋白交联及组织内沉积；加速创面上皮化；增强巨噬细胞吞噬创面坏死组织，释放细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子及纤维连接蛋白的作用［16］。锌不仅能够提高生长激素水平，使后者对胰岛素样生长因子－1诱导作用增强，而且对表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及其受体的表达有促进作用，从而加速表皮细胞增殖和胶原的沉积，促进创面愈合［17］。维生素E可降低毛细血管通透性，与维生素A都有抗氧化作用［18］。康肤霜外敷创面可使局部潮湿、缺氧。潮湿环境有利于间生态组织恢复活力。低氧环境可刺激毛细血管增生，改善局部血液循环；加速坏死组织的溶解；促进多种生长因子的释放；利于表皮细胞的迁移及间生态组织恢复活力［19］。但潮湿环境也利于细菌繁殖，康肤霜成分中的洗必泰、冰片具有抗菌、消炎作用［20－21］，结合及时清创与换药，可避免创面感染，为加速创面修复提供良好的局部环境。本实验证实康肤霜具有明显加快糖尿病烫伤创面愈合的作用，这与康肤霜中多种配方成分的综合促愈合作用有关，对于其促进糖尿病创面愈合的机制尚需进一步深入研究。

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