系统性红斑狼疮患者静脉血BCMA和CD138＋浆细胞的研究＊

牛晓昶，曾照芳，贾 佳，李艳林，夏 季，黄恒柳，邓少丽△

（1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科，重庆400042；2.重庆医科大学检验系 400016；3.重庆医科大学附属儿童医院 400014）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）简称红斑狼疮，是由多克隆自身反应性B细胞介导的自身免疫性疾病，B细胞异常激活并异常分化为浆细胞和记忆性效应细胞，其直接的致病因子是多克隆自身抗体，并以免疫复合物的形式造成多种组织器官损伤。虽然目前对于引起SLE的确切病因仍不明确，但是SLE中异常浆细胞分泌多种致病性自身抗体导致SLE的发生已成共识，这些抗体主要来源于浆细胞。浆细胞存活及其抗体分泌功能主要由B淋巴细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）调控，虽然BCMA作用的相关机制至今尚未完全清楚，但是已有研究显示BCMA在浆细胞的存活中发挥重要作用［1］。因此，阻断BCMA可选择性抑制浆细胞的存活，减少抗体的分泌，BCMA成为治疗SLE的潜在靶点。白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）138是浆细胞特异的膜抗原，是成熟浆细胞的标记。本研究从BCMA蛋白维持浆细胞存活的角度出发，探讨BCMA表达和CD138＋浆细胞数量在SLE患者和健康人体内存在的差异，为研究SLE的发病机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 主要试剂包括：人BCMA酶联免疫吸附测定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美国R＆D公司，Ficoll细胞分离液购自美国GE公司，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）购自北京中衫金桥生物技术有限公司，Trizol为Invitrogen公司产品，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）原液为Sigma公司产品，实时聚合酶链反应（real time－polymerase chain reaction，RTPCR）试剂盒购自Promega公司。抗CD138－藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、CD38－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、CD19－FITC、CD45－藻红蛋白－花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）、CD56－PE、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5抗体均购自BECKMAN公司，Taq酶购自Promega公司。主要仪器包括：CFX－96实时荧光定量PCR仪（Bio－Rad公司）、ND－1000微量紫外可见分光光度计（美国Nanodrop公司）、流式细胞仪（美国Backman公司），MK3酶标分析仪（芬兰雷勃公司）。

1.2 材料 选择2009年4月至2011年6月于第三军医大学大坪医院就诊的40例临床确诊的SLE患者作为SLE组，均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准，年龄15～54岁，平均（34.0±6.0）岁。将同期进行健康体检的30例健康人作为对照组，年龄26～49岁，平均（35.0±5.0）岁。取上述患者及健康人的静脉血进行研究，采集的血液标本用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝。

1.3 引物 BCMA 引物：上游5′－GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG－3′，下游5′－TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC－3′；BCMA 荧光探针：FAM－5′－CGA CTC TGA CCA TTG CTT TCC ATC CCC A－3′。B2 M 引 物：上 游 5′－TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C－3′，下 游 5′－ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G3′；B2 M 探 针：FAM－5′－TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA－3′。上述引物和荧光探针均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4 ELISA法检测 BCMA （1）包被：以 PBS将72μg／mL捕获抗体稀释至终浓度为0.4μg／mL，将其加入空白微孔板（100μL／孔），室温过夜，0.05%Tween20洗涤液洗板3次，甩干；（2）封闭：以试剂稀释剂（含1%牛血清清蛋白的PBS液）封闭微孔，每孔300μL，室温放置至少1h，0.05%Tween20洗涤液洗板3次，甩干，备用；（3）加样：以试剂稀释剂稀释重组人BCMA标准品，对倍稀释，稀释后终浓度为31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00pg／mL，将其 分 别加入100μL标准液或待测血清，室温放置2h，以0.05%Tween20洗涤液洗板3次，甩干；（4）加入生物素化羊抗人BCMA抗体：以试剂稀释剂将36μg／mL检测抗体稀释至终浓度为200ng／mL，每孔100μL，室温放置2h，0.05%Tween20洗涤液洗板3次，甩干；（5）加入链霉亲和素－辣根过氧化物酶（streptavidin－horseradish peroxidase，SA－HRP）：SA－HRP以试剂稀释剂按1∶200稀释后加入微孔中，每孔100μL，避免强光直射，放置室温20min，以0.05%Tween20洗涤液洗板3次，甩干；（6）显色、测定：每孔加入显色剂A和显色剂B各50μL，避免强光直射，放置室温20min后加入终止液50μL，在酶标仪上读取450nm处光密度（optical density，OD）值；绘制标准曲线，计算待测样本的BCMA含量。

1.5 单个核细胞RNA的提取 用Ficoll细胞分离液通过离心（离心半径9cm，2 000r／min离心20min），将标本中的单个核细胞分离出来，用1%PBS洗涤，然后再离心（2 500r／min离心10min），去上清液，留单个核细胞于管底。用Trizol破裂细胞，氯仿、异丙醇和75%乙醇萃取、沉淀，提取细胞RNA，将RNA溶解在无核酸酶水中，测定其浓度和纯度，为不影响实验结果，浓度应不小于300ng／μL，A260／A280不小于2.0。根据RT－PCR试剂盒说明书取1mg RNA进行逆转录得到cDNA，－20℃冻存备用。

1.6 荧光定量RT－PCR检测 反应体系：Free water 3.4μL、Mix混合液5.0μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、BCMA探针0.3μL、Taq酶0.2μL、cDNA 0.5μL、总体积10.0μL。PCR反应条件：95℃预变性3min后，95℃变性10s，58℃退火30s，共45个循环。计算的周期阈值（cycle threshold，Ct），根据相对定量2－ΔΔCt法计算SLE组和对照组静脉血BCMAmRNA的差异。

1.7 流式细胞术检测 将两组标本在Ficoll细胞分离液的作用下离心（离心半径9cm，2 000r／min离心20min），收集单个核细胞，用1%PBS洗涤。将 CD138－PE、CD38－FITC、CD19－FITC、CD45－PC5、IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5荧光抗体标记的单 个 核 细 胞 分 为 3 组：（1）CD38－FITC、CD138－PE 及CD45－PC5标记细胞组；（2）CD19－FITC、CD138－PE 及 CD45－PC5标记细胞组；（3）IgG1－PE／IgG1－FITC／IgG1－PC5及 CD45－PC5标记细胞组。3组细胞均孵育1～2h后上机检测。

1.8 统计学处理 应用SPSS12.0软件进行统计学处理，计量数据用±s表示，组间差异的比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清ELISA检测分析 SLE组患者血清BCMA水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 SLE患者与健康者血清BCMA水平的比较

2.2 荧光定量RT－PCR分析 经45次循环，荧光定量RTPCR反应曲线见图1。SLE组患者的ΔCt值明显高于对照组的ΔCt值，差异有统计学意义（P＜0.05），SLE组为0.811，对照组为1.716。经2－ΔΔCt法计算（－ΔΔCt＝SLE组－对照组），SLE组患者BCMA基因的含量是对照组的1.873倍，见图2。

图1 荧光定量RT－PCR反应曲线

图2 SLE组和对照组的ΔCt分布情况和ΔCt值

图3 SLE组（左）和对照组（右）患者的流式细胞术检测结果

2.3 流式细胞术分析 流式细胞技术检测结果显示，SLE组患者静脉血浆细胞数量明显高于对照组，见图3。

3 讨 论

BCMA为B细胞表面分子，是由184个氨基酸残基组成的非糖基化单链Ⅰ型蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家 族，是 Ⅰ 型 跨膜受体［2］。BCMA 表达于 B细胞的生发中心［3］、成熟 B细胞［4－5］以及成熟浆细胞 表 面［1，6］。B 细 胞 激 活 因 子 （B cell activating factor，BAFF）是B细胞产生、发育和自身反应所必需［7－9］。BCMA可与BAFF配体相结合，其可能机制是BCMA与BAFF蛋白结合，使抗凋亡基因Bcl－2、Mcl－1的表达上调，维持浆细胞生长，成为长寿浆细胞，从而增加成熟浆细胞的数量及其抗体的分泌［9］。在自身免疫疾病患者，尤其是SLE患者体内可检测出高水平的BAFF［10－11］，因此，在维持浆细胞的存活中BCMA 发挥了重要的作用。BCMA基因位于16p13，mRNA全长约1.2kb［12］。人类浆细胞、生发中心 B淋巴细胞［3］以及小鼠浆细胞的BCMA表达明显升高，其缺失会缩短骨髓长寿浆细胞生存时间［1］。分析B细胞发育过程的基因表达谱，发现BCMA随着B细胞的发育成熟而出现，其表达量逐渐增加，且只表达于成熟B淋巴细胞及浆细胞，为维持浆细胞存活所必需，在B细胞发育的时空性上具有一致性［13］。BCMA虽在生发中心B细胞中表达，但它对外周B细胞的数量、各种外周B细胞亚型的分布以及B细胞的寿命没有明显影响，在成熟B细胞分化到浆细胞阶段，其BCMA表达较多，BCMA可能与调控浆细胞存活及抗体分泌功能有关。浆细胞是致病性自身抗体的直接来源，40%自身抗体分泌性浆细胞是长寿命的，长寿浆细胞产生的自身抗体可反复激活潜在的病理免疫应答反应［14］。BCMA基因剔除小鼠有正常的脾结构，B细胞发育正常，T细胞非依赖性免疫反应和T细胞依赖性免疫反应未见明显异常，但浆细胞数量明显减少，这又证明BCMA在维持浆细胞存活中的重要性［1］。

CD138＋能特异性地标记成熟浆细胞，本研究利用这一特征对SLE组和对照组静脉血的单个核细胞进行流式细胞术分析，比较两组CD138＋浆细胞数量的差异。本研究将荧光定量RT－PCR技术、流式细胞术及ELISA结合，研究维持浆细胞存活的重要因子BCMA。其结果显示SLE组血清BCMA明显高于对照组，SLE组体内BCMA基因表达的相对量是对照组的1.873倍，且流式细胞术显示SLE组患者静脉血CD138＋浆细胞的数量也明显高于对照组，提示在SLE患者体内BCMA基因高表达，SLE患者体内浆细胞数量的增加与BCMA高表达相关，这为进一步了解SLE发病机制提供了新的线索，为SLE治疗提供了新的方向和靶点。

［1］ O′connor BP，Raman VS，Erickson LD，et al.BCMA is essential for the survival of long－lived bone marrow plasma cells［J］.J Exp Med，2004，199（1）：91－98.

［2］ Lofton－Day C，Moore M，Littau A，et al.TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B－cell autoimmune disease［J］.Nature，2000，404（6781）：995－999.

［3］ Ng LG，Sutherland AP，Newton R，et al.B cell－activating factor belonging to the TNF family （BAFF）－R is the principal BAFF receptor facilitating BAFF costimulation of circulating T and B cells［J］.J Immunol，2004，173（2）：807－817.

［4］ Gras MP，LaâbiY，Linares－Cruz G，et al.BCMAp：an integral membrane protein in the Golgi apparatus of human mature B lymphocytes［J］.Int Immunol，1995，7（7）：1093－1106.

［5］ Thompson JS，Schneider P，Kalled SL，et al.BAFF binds to the tumor necrosis factor receptor－like molecule B cell maturation antigen and is important for maintaining the peripheral B cell population［J］.J Exp Med，2000，192（1）：129－135.

［6］ Avery DT，Kalled SL，Ellyard JI，et al.BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells［J］.J Clin Invest，2003，112（2）：286－297.

［7］ Mackay F，Schneider P，Rennert P，et al.BAFF AND APRIL：a tutorial on B cell survival［J］.Annu Rev Immunol，2003，21：231－264.

［8］ Mackay F，Silveira PA，Brink R.B cells and the BAFF／APRIL axis：fast－forward on autoimmunity and signaling［J］.Curr Opin Immunol，2007，19（3）：327－336.

［9］ Benson MJ，Dillon SR，Castigli E，et al.Cutting edge：the dependence of plasma cells and independence of memory B cells on BAFF and APRIL［J］.J Immunol，2008，180（6）：3655－3659.

［10］Cheema GS，Roschke V，Hilbert DM，et al.Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with systemic immune－based rheumatic diseases［J］.Arthritis Rheum，2001，44（6）：1313－1319.

［11］Zhang J，Roschke V，Baker KP，et al.Cutting edge：a role for B lymphocyte stimulator in systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2001，166（1）：6－10.

［12］Shu HB，Johnson H.B cell maturation protein is a receptor for the tumor necrosis factor family member TALL－1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（16）：9156－9161.

［13］Shapiro－Shelef M，Calame K.Regulation of plasma－cell development［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（3）：230－242.

［14］Levesque MC，St Clair EW.B cell－directed therapies for autoimmune disease and correlates of disease response and relapse［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（1）：13－21.