卿小松,孔宪炳
(重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 400016)
三磷腺苷结合盒转运体G2(ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2)是近年来发现的三磷腺苷结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体蛋白家族新成员。研究表明,ABCG2参与了多种肿瘤的发生、发展及耐药,并能维持干细胞特性[1-2]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-lα)是目前发现的介导细胞低氧反应最关键的核转录因子,它可促进血管形成,维持细胞氧及代谢平衡,以保证肿瘤生长,并导致化疗耐受[3-4]。本实验研究了在缺氧条件下人肝癌SMMC-7721细胞ABCG2和HIF-1α表达的变化,探索二者表达的关系,并进一步探讨缺氧诱导ABCG2表达的可能机制,为抗肿瘤治疗提供理论依据。
1.1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞株由重庆医科大学普外科学重点实验室提供。RPMI 1640培养基、小牛血清购于Gibco公司;抗HIF-1α多克隆兔抗人抗体购自Santa Cruz公司;抗ABCG2多克隆兔抗人抗体购自武汉博士德公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗兔第二抗体及增强化学发光(enhanced chemiluminecence,ECL)试剂盒购于碧云天生物技术公司;HIF-lα抑制剂3-(5′-羟甲基-2′-呋喃 )-1-苄 基 吲 唑 [3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole,YC-1]购自Cayman公司;全细胞裂解液及聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜购自博海生物有限公司。
1.2 细胞培养 SMMC-7721细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中培养,将其分为对照组及缺氧组。对照组在5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞生长至60%汇合状态时,缺氧组细胞放入含1%O2、94%N2、5%CO2混合气体的培养箱培养,根据缺氧时间,缺氧组再分为缺氧24h组、缺氧48h组及缺氧72h组。
1.3 HIF-1α与ABCG2蛋白的检测 收获培养的各组细胞,按照全细胞裂解液说明书提取细胞总蛋白,二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定总蛋白浓度。取50μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至PVDF膜上,丽春红染色证实转移成功,5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原,第一抗体封闭过夜,第二抗体37℃孵育1h。第一抗体HIF-1α抗体1∶100稀释,ABCG2抗体1∶100稀释,第二抗体工作浓度均为1∶1 000。ECL显影,Bio-Rad凝胶成像系统采集图片,将 HIF-1α与ABCG2灰度值分别与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)灰度值的比值作为蛋白表达水平的参数,对产物相对定量,实验重复3次。
1.4 YC-1抑制 SMMC-7721细胞 HIF-1α表达后对 ABCG2表达的影响 将缺氧72h组SMMC-7721细胞加入 HIF-1α抑制 剂 YC-1,按 YC-1 终 浓 度 分 为 YC-1 1.0、2.0 及4.0μmol/L组,将不含 YC-1的缺氧72h组SMMC-7721细胞设为YC-1对照组。各组分别处理24h后,采用Western blot检测各组细胞中HIF-1α、ABCG2蛋白的表达。实验重复3次。
1.5 统计学处理 所有数据采用SPSS17.0软件行统计学分析,数据以±s表示,行SNK方差分析及Pearson相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 缺氧环境SMMC-7721细胞 HIF-1α、ABCG2蛋白的表达 Western blot结果显示,与对照组比较,在缺氧条件下SMMC-7721细胞中 HIF-1α蛋白表达上调,HIF-1α的表达在缺氧24h时即开始增加,48h稳步上升,72h达到高峰,各缺氧组SMMC-7721细胞HIF-1α的表达与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图1、表1。ABCG2的表达趋势同HIF-1α的表达,二者表达呈正相关(r=0.944,P<0.05),表明随着缺氧的加剧,HIF-1α与ABCG2蛋白表达逐渐增加。
图1 Western blot检测缺氧环境SMMC-7721细胞HIF-1α与ABCG2蛋白的表达
表1 Western blot检测SMMC-7721细胞中 HIF-1α与ABCG2蛋白的表达(±s)
表1 Western blot检测SMMC-7721细胞中 HIF-1α与ABCG2蛋白的表达(±s)
*:P<0.05,与对照组比较;#:P<0.05,与缺氧24h组比较;△:与缺氧48h组比较。
组别 HIF-1αABCG2对照组0.184±0.017 0.087±0.017缺氧24h组 0.289±0.044* 0.166±0.019*缺氧48h组 0.385±0.044* 0.227±0.034*缺氧72h组 0.608±0.090*#△ 0.344±0.061*#△
图2 不同浓度 YC-1对SMMC-7721细胞 HIF-1α、ABCG2蛋白表达的影响
2.2 YC-1抑制 SMMC-7721细胞 HIF-1α表达后对 ABCG2表达的影响 Western blot检测结果显示,随着YC-1浓度的增加,缺氧72h组SMMC-7721细胞中HIF-1α蛋白表达逐渐减少,同时 ABCG2表达亦逐渐下降,除 YC-1 1.0μmol/L组与YC-1 2.0μmol/L组比较,差异无统计学意义外,其余各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2、表2。
表2 不同浓度 YC-1对 HIF-1α、ABCG2表达的影响(±s)
表2 不同浓度 YC-1对 HIF-1α、ABCG2表达的影响(±s)
*:P<0.05,与对照组比较;#:P<0.05,与 YC-1 1.0μmol/L组比较;△ :与 YC-1 2.0μmol/L组比较。
组别 HIF-1αABCG2 YC-1对照组0.615±0.059 0.509±0.087 YC-1 1.0μmol/L组 0.387±0.054* 0.287±0.039*YC-1 2.0μmol/L组 0.315±0.030* 0.239±0.033*YC-1 4.0μmol/L组 0.085±0.020*#△ 0.105±0.019*#△
ABCG2首次发现于乳腺癌 MCF-7/Adr-Vp3000细胞系,因此,又称为乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)[5]。随着研究的深入,人们发现它在多种肿瘤组织及肿瘤细胞中亦有表达[6-7]。ABCG2作为一种转运体,可以将多种化学结构不同的药物“泵出”细胞外,其转运的药物包括:多柔比星、米托蒽醌、长春新碱、紫杉醇及拓扑替康等,其介导的多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是导致临床化疗失败的原因之一[8-9]。肿瘤生长快,代谢旺盛,耗氧量大,而肿瘤内部的血管生成则相对较慢,因而缺氧几乎是所有实体瘤微环境的共同特征。缺氧时细胞内亚铁血红素、卟啉类化合物等物质大量堆积,它们可破坏细胞DNA、蛋白质及包膜脂质。此外,缺氧微环境还是造成化疗耐药的原因之一。
赵大伟等[10]发现ABCG2蛋白在正常肝组织及肝硬化组织中均有表达,呈弱阳性。在肝癌组织中,ABCG2表达约2/3呈弱阳性,1/3呈强阳性;ABCG2表达水平与肿瘤直径及数目有关。ABCG2还是肝癌侧群细胞表型的主要因素,后者具有肿瘤干细胞特性,而肿瘤干细胞目前被认为是维持肿瘤生长及化疗失败的根本原因[10-12]。因此,ABCG2可能对维持肝癌生长和化疗耐药发挥重要作用。本研究发现,缺氧环境中SMMC-7721细胞ABCG2的表达较常氧环境中的表达增加,这与Krishnamurthy等[13]的研究结果相符。同时本实验结果还显示,ABCG2的表达随缺氧时间的延长而增加,随着缺氧加剧,细胞能量供求矛盾突出,细胞内糖酵解途径代谢物不断积累,肿瘤细胞上调ABCG2表达以将这些代谢产物排出体外,抵抗缺氧带来的伤害,而由此导致的ABCG2表达增加可能是缺氧下肿瘤细胞耐药的机制之一。
HIF-lα在细胞缺氧信号途径中处于核心位置,它可以促进新生血管形成,维持氧及代谢平衡,以保证肿瘤生长和促进其转移,并引起化疗耐受[3]。本研究发现,在缺氧时SMMC-7721细胞HIF-lα的表达强于常氧环境,并随着时间延长而增加,这表明在持续缺氧条件下,肿瘤细胞可通过上调HIF-lα的表达来维持氧及代谢平衡,促进细胞生长,而这种表达趋势也与相关文献报道一致[14]。
本研究还发现,ABCG2和 HIF-1α在SMMC-7721细胞中的表达水平随着缺氧信号的加强而呈现出一致的增高趋势,且二者表达呈正相关。有关研究显示,HIF-1α可调控40余种基因的表达,诸如MDR1便是其调控的靶基因之一[15],而MDR1基因编码产物 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-GP)与 ABCG2同属ABC转运体家族,这就提示ABCG2是HIF-1α的下游目的基因,HIF-1α可上调ABCG2的表达。为了证明这一假设,本研究采用 HIF-1α抑制剂YC-1干预 HIF-1α的表达,发现随着YC-1浓度的增加,HIF-1α的表达水平逐渐下降,更重要的是,ABCG2的表达亦逐渐降低,这表明ABCG2是HIF-1α的相关调控蛋白,缺氧对ABCG2的调控是通过HIF-1α的机制而实现的。
综上所述,缺氧环境中,SMMC-7721细胞ABCG2和HIF-1α的表达上调,并随时间延长而增加,YC-1抑制HIF-1α后可有效下调ABCG2的表达。本实验表明缺氧时SMMC-7721细胞生存及耐药的机制可能是通过缺氧诱导HIF-1α的表达而实现,后者上调ABCG2的表达,增强了肿瘤细胞对缺氧环境的适应能力及化疗抵抗能力。抑制HIF-1α-ABCG2这一途径有望成为治疗肝癌以及逆转肝癌患者耐药的治疗靶点。
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