选择性激光小梁成形术对小梁网显微结构影响及降压机制研究

李忠强 闫小四 马景学

病理性高眼压是青光眼相关视神经损害的最危险因素，故降低和稳定眼内压至靶水平是青光眼治疗的首要任务。目前临床降低眼压的方法主要有药物、手术和激光疗法三种。氩激光小梁成形术(argon laser trabeculoplasty，ALT)可成功降低原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)的眼内压［1］，但降压效果不持久，可能与ALT对眼前房角小梁网造成凝固性破坏并对周围无色素细胞和组织产生热损伤有关［2］。为解决上述问题，自1995年对选择性作用于色素性小梁激光进行了研究，发现了倍频Q开关Nd:YAG激光能选择性作用于色素性小梁细胞，具有确切降低眼压效果，对周围组织无热损伤和凝固作用，即选择性激光小梁成形术(selective laser trabeculoplasty，SLT)［3］。SLT的应用为开角型青光眼患者的治疗开辟了一条安全有效的新途径。本实验采用组织形态学观察弥猴眼SLT术后眼前房角小梁网组织的显微结构改变，探讨SLT降低眼内压的可能机制，使该技术在临床上得到合理应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年恒河猴6只，雌雄各3只，体重6～7 kg，年龄3～4岁。由河北医科大学第二医院动物室提供。术前常规眼科检查(裂隙灯、眼底镜、房角镜、眼压计)，排除眼病和前房角结构变异，房角为开角型。

1.2 主要仪器设备 裂隙灯显微镜(TOPCON，日本)，间接眼底镜(Ra-200型，北京)，压陷式眼压计(苏州)，手术显微镜(OMS610，TOPCON，日本)，Lumenis Selecta dute 激光器(美国)，Olympus显微镜(日本)，扫描电子显微镜(日立S-3500N，日本)，透射电子显微镜(日立H-7500，日本)，LEICA显微照相系统(德国)。

1.3 主要溶液配制 A液:磷酸二氢钾1.816 g溶于200 ml双蒸水;B液:磷酸二氢钠5.5 g溶于200 ml双蒸水。4%戊二醛固定液配制:A液(10 ml)+B液(50 ml)+25%戊二醛原液(12 ml);2.5%戊二醛固定液配制:4%戊二醛(95 ml)+50%戊二醛原液(5 ml)。

1.4 SLT治疗步骤 分别标记实验猴1～6号，术前6 h禁食水，按每公斤体重10 mg肌内注射氯胺酮全身麻醉后行右眼爱尔卡因表面麻醉，置专用房角镜，接受lumenis selecta dute激光器治疗，采用SLT档激光即倍频Q-开关ND:YAG激光，照射范围为上方180°小梁网。治疗参数:波长532 nm，脉冲时间3 ns，光斑直径400 μm，光斑相邻但不重叠，点数50～80个。初始能量设置为0.8 mJ，以刚能看到激光照射点出现小气泡后减少0.1 mJ为治疗能量。左眼做为正常对照。术后1周，6只实验弥猴行双眼上方小梁切除术，小梁组织大小约2×3 mm，1、3、5号猴做扫描电镜观察，2、4、6号猴做透射电镜观察。

1.5 扫描电镜步骤 小梁组织标本迅速放入2.5%戊二醛中固定4 h以上，双蒸馏水浸洗4次;50%、70%、80%和90%乙醇逐级脱水，然后置入100%乙醇脱水2次，每次20 min。叔丁醇干燥，75%液20 min，100%液2次，每次20 min，真空干燥2 h;标本喷金，观察与照相。

1.6 透射电镜步骤 小梁组织标本迅速放入4%戊二醛前固定4～6 h，1/15 mol/L磷酸缓冲液浸洗3次以上;1%四氧化锇后固定1～2 h;1/15 mol/L磷酸缓冲液浸洗2次，每次20 min;丙酮逐级脱水50%、70%、80%、90%、100%2次，每次15 min。之后浸透与包埋:纯丙酮:包埋剂(1∶1)37℃温箱1 h，再置入纯丙酮:包埋剂(1∶3)37℃温箱3 h以上，最后纯包埋剂浸透37℃温箱5 h以上。50 μm超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，电镜观察与照相。

2 结果

2.1 正常弥猴眼前房角小梁网电镜结果 正常弥猴眼前房角小梁网由基质、胶原纤维、弹性纤维和内皮细胞组成。中心为胶原纤维，埋于均匀基质中。胶原纤维间有少量弹性纤维。小梁网的表面覆盖一层内皮细胞。内皮细胞宽而扁平，有突起，有的突起很长，与相邻细胞连接成单层网状(图1)。内皮细胞中含有丰富膜样细胞器。

2.2 SLT治疗后1周小梁网电镜结果 扫描电镜观察小梁网结构完整，小梁柱层次清楚，没有见到凝固性损伤及热损伤，只有小梁限局性的裂隙样改变，小梁网间隙中可见较多体积较大的吞噬细胞(对照组未见)(图2、3);透射电镜下见色素性小梁网内皮细胞内可见部分黑色素颗粒崩解、外溢(图4A、B)。

图1 正常猕猴小梁网扫描电镜，小梁网由基质、胶原纤维、弹性纤维和内皮细胞组成，结构清晰(SEM×700)

图2 SLT后1周猕猴小梁网扫描电镜，小梁组织限局性裂隙样改变(箭头)。无凝固性损伤及热损伤改变(SEM×2 000)

图4A 正常弥猴眼前房角小梁网透射电镜(TEM)，色素性小梁网内皮细胞内可见密集的色素颗粒(箭头)(TEM×20 000)

图4B SLE后1周猕猴小梁网透射电镜，色素性小梁网内皮细胞内部分黑色素颗粒崩解、外溢(箭头)(TEM×20 000)

图3 SLT后1周猕猴小梁网扫描电镜，小梁网间隙中可见较多体积较大的吞噬细胞(箭头)(SEM×1 200)

3 讨论

开角型青光眼除传统的药物疗法和手术治疗外，还可通过激光治疗降低眼压。抗青光眼药物治疗是一种终身疗法，不仅患者依从性差，有药物漂移现象，且治疗费用昂贵，患者常难以坚持治疗，因此开角型青光眼的激光疗法越来越受到重视。1979年Wise和Witter首次报告用低能量氩离子激光ALT治疗POAG，其降压机制尚无定论，一般认为是激光的热效应使小梁纤维板层收缩，加宽了小梁间隙，同时打开了Schlemm’s管，从而减少了房水排出阻力而降低眼压［4］。经二十余年的临床实践，ALT的安全性和有效性已得到临床医生的广泛接受，但ALT对小梁网可造成凝固性破坏并对周围无色素细胞和组织产生热损伤，且在激光斑之间形成膜样结构和瘢痕组织，从而使降眼压效果不能持久，并限制了激光治疗的重复应用和进一步药物治疗的效果［2，3，5，6］。由于上述缺点，ALT 仍不能代替抗青光眼药物成为治疗开角型青光眼的首要选择。

为了解决上述问题，1995年Latina和Park发明了选择性激光小梁成形术(SLT)，应用于治疗POAG并取得了良好疗效。SLT采用Q开关、倍频Nd:YAG激光，脉冲时间3 ns，激光光斑400 μm，激光波长532 nm，脉冲能量小于2 mJ。选择性作用于色素性小梁细胞，使邻近组织不受损害，保持了小梁组织的结构完整，弥补了ALT的不足。

3.1 采用弥猴眼小梁组织标本进行SLT研究的意义 因临床上患者接受SLT治疗后短期内再行小梁切除术的病例很少，且因手术限制不能进行与自身正常小梁组织的对照，而弥猴眼小梁组织结构与人眼虽然有些差别(如其小梁较人眼短而粗)，但与人眼小梁有相似的超微结构，故我们采用猴眼小梁组织标本进行对SLT术后显微结构的研究。本实验之所以选择对SLT术后1周时的猴眼小梁组织进行电镜观察，是因为较长时间和较多时间点的显微观察需要更多的实验动物，实验动物来源困难，数量有限，我们只能选择炎性反应和显微结构改变都趋于稳定的术后1周这个时间点进行观察，这是本实验的不足。本实验电镜结果表明，SLT术后扫描电镜检查未发现小梁网的结构破坏，未发现有凝固性损伤及热损伤，只有局部小梁架的裂隙样改变，小梁间隙中可见体积较大的吞噬细胞(对照组未见)。透射电镜显示色素性小梁内皮细胞内黑色素颗粒崩解，外溢。这与国外研究结果相同，Kramer等［7］在比较人尸体眼球SLT和ALT术后电子显微镜下急性形态学改变时也发现，与ALT不同，SLT术后小梁网结构完整，没有发现凝固性损伤，机械性损伤(局部小梁断裂)也比较少，激光的显微证据表现为透射电镜显示的色素性小梁内皮细胞内黑色素颗粒崩解和小梁内皮细胞破坏。以上结果证实了Latina的说法，即SLT选择性作用于色素性小梁细胞而对无色素细胞及周围组织结构无热损伤及凝固作用。

3.2 SLT的降压机制 激光的选择性光热解效应理论认为，要使激光对靶组织具有高度特异性，须具备三个条件:(1)细胞内的靶物质含量远多于周围组织;(2)激光波长与靶组织吸收波长相符;(3)激光脉冲时间小于或等于靶组织的热驰豫时间(即靶组织将电磁能转化为热能所需的时间)。SLT的治疗作用就是通过上述原理实现的，它提供了产生极短的激光脉冲的物质基础。另一方面，SLT的作用对靶组织有一定要求:(1)靶细胞内含有色素;(2)靶细胞必须比其周围的组织容易吸收激光能量。人眼功能小梁由两种细胞组成，即含有色素的小梁细胞和不含色素的小梁细胞。因此，人眼功能小梁提供了SLT选择性光热解作用的靶细胞。

从实验结果看，SLT不同于ALT，它只选择性作用于色素性小梁细胞，对无色素细胞和周围组织不产生凝固性破坏和热损伤，不会造成小梁间隙和Schlemm’s管的扩张;同时我们发现，SLT术后小梁间隙中吞噬细胞较对照组明显增多，故我们推测SLT降眼压的机制存在于细胞水平。巨噬细胞可以修复由于损伤、疾病和老化引起的组织改变。SLT作用于小梁网后使单核细胞和巨噬细胞数量增加，通过激活的巨噬细胞对残留物和小梁组织色素颗粒的搬运或吞噬作用增加小梁细胞的房水外流功能。Alvarado［8］等在对猴眼的研究中发现，SLT术后猴眼小梁网的单核细胞及巨噬细胞数量较未治疗眼增加5～8倍，他们认为，SLT术后引起的色素性小梁细胞损伤可导致多种细胞因子或化学因子的释放，后者可激活单核细胞并使其转化为巨噬细胞，而巨噬细胞可以吞噬、清除小梁组织的色素颗粒，并经Schlemm’s管运出眼外，从而达到降低眼压的效果。也有人认为，SLT对色素细胞的损伤产生了细胞因子和趋化因子，如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等，这些细胞因子中的一部分在减少金属蛋白酶中起重要作用，而后者可以改变促进房水外流的小梁网组织的细胞外基质，从而增加房水外流量［8］。

综上所述，动物实验研究表明，SLT对小梁组织没有热损伤及凝固作用，可以保留小梁组织结构的完整性，故可以重复治疗，是较ALT更合理而安全的激光治疗方法。

1 Wise JB，Witter SL.Argon laser therapy for open-angle giaucoma:a pilot study.Arch Ophthalmol，1979，97:319-322.

2 Alexander RA，Grierson I.Morphological effects of argon laser trabeculoplasty upon the glaucomatous human meshwork.Eye，1989，3:719-726.

3 Latina MA，Park C.Selective targeting of trabecular meshwork cells:in vitro studies of pulsed and continuous laser interactions.Exp Eye Res，1995，60:359-372.

4 刘学英.小梁切除术联合超声乳化治疗闭角型青光眼疗效分析.河北医药，2011，33:3625.

5 Damji KF，Shah KC，Rocr WJ，et al.Selective laser trabeculoplasty v argon laser trabeculoplasty:a prostective randomized clinical trial.Br J Opthalmol，1999，83:718-722.

6 Hollo G.Argon and low energy，pulsed Nd:YAG laser trabeculoplasty.Acta Ophthalmol Scand，1996，74:126-131.

7 Kramer TR，Noecker RJ.Comparison of the morphologic changes after selective laser trabeculoplasty and argon laser trabeculoplasty in human eyebank eyes.Ophthalmology，2001，108:773-779.

8 Alvarado JA，Alvarado RG，Yeh RF，et al.A new insight into the cellular regulation of aqueous out flow:how trabecular meshwork endothelial cells drive a mechanism that regulates the permeability of Schlemm’s canal endothelial cells.Br J Ophthalmol，2005，89:1500-1505.