糖尿病神经痛大鼠脊髓背角NMDA受体表达的变化

刘飞飞 马江红 王秀丽

糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，其发病率逐年增高，约占30%，其发病机制及病理生理机制十分复杂，临床上缺乏有效的治疗药物和手段。NMDA受体是一种配体门控离子型谷氨酸受体，是兴奋性氨基酸受体系统的重要组成部分。NMDA受体是由NR1和NR2亚单位组成的异五聚体，NR1是NMDA受体复合物的功能单位，NR2是调节单位。NMDA受体不仅参与学习记忆、突触可塑性及神经发育等生理功能的调节，而且，在疼痛、神经退行性变、癫痫等病理过程中发挥重要作用。目前研究表明:外周神经损伤大鼠脊髓背角神经元上NMDA受体表达上调［1，2］，而DNP大鼠脊髓背角NMDA受体各亚基的表达变化目前还不清楚。本研究通过制备DNP大鼠模型，探讨其脊髓背角NMDA受体各亚基的表达变化，为临床治疗DNP提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 清洁级雄性SD大鼠24只，由河北医科大学动物实验中心提供，4周龄，体重130～150 g，室温20～25℃，昼夜交替，自由进食水，适应环境5 d进行实验。随机分为2组:正常对照组(C组，n=9)和DNP组(D组，n=15)。

1.2 DNP模型的制备 参考文献［3］介绍的方法，禁食12 h后腹腔注射链脲霉素(STZ，Sigma公司，美国)50 mg/kg，C组给予等容量0.9%氯化钠溶液。

分别于注射STZ或0.9%氯化钠溶液后1、2、3周采集尾静脉血样0.5 ml，采用酶学方法测定空腹血糖浓度，ACCU-CHEK血糖分析仪由德国Roche公司提供，D组空腹血糖浓度 ＞16.7 mol/L为糖尿病模型制备成功;采集血样后，待大鼠安静测定机械缩足阈值(PWT)＜4 g时，为糖尿病神经痛模型成功，否则剔除，予以补充。然后取L1～5节段脊髓组织，采用免疫组织化学法法测定脊髓背角NMDA受体表达水平。

1.3 PWT的测定 参照文献［3］介绍的方法，采用“up-anddown”方法，将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。使大鼠适应环境15 min，用一系列标准化的Von Frey针垂直刺激大鼠后足底，使其弯曲成S形，持续6～8 s，在刺激时间内或在移开Von Frey丝时发生缩足反应，记为阳性反应，直至出现第1次阳性阴性(或阴性阳性)反应的骑跨，连续测4次。应用Dixon［4］报道的方法推算出50%缩足反应阈值。

1.4 免疫组织化学测定脊髓背角NR1和NR2B亚单位的表达腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉下，迅速开胸，经左心室至升主动脉插管，先以100ml0.9%氯化钠溶液洗去血液，随后用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH值7.4)灌注1 h，取L1～5节段脊髓组织。常规固定、脱水、石蜡包埋，切片(片厚5μm)。滴加3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加NR1亚单位一抗 (博奥森公司，北京，1∶200稀释)37℃孵育过夜。次日滴加生物素化的兔抗鼠抗体(北京博奥森公司)，37℃40 min。DAB(北京博奥森公司)显色。NR2B亚单位一抗、二抗(中杉金桥公司，北京，1∶200稀释)代替NR1亚单位一抗、二抗，实验步骤相同。用PBS替代一抗作为阴性对照。采用Motic Digital Image病理图像采集软件(Olympus公司，日本)与Quantity One软件(Bid-Rad公司，美国)进行分析，每个标本取4张切片，每张切片在脊髓背角选取大致相同部位的视野，光镜(200倍)计数NR1和NR2B阳性表达的细胞数，取4张切片的平均值反映阳性细胞的表达水平。细胞膜及细胞浆均呈深棕色为表达阳性细胞。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，进行随机趋组资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组不同时点血糖与PWT比较 给予STZ后不同时点PWT＜4 g;与C组比较，D组空腹血糖升高，PWT降低 (P＜0.05)。见表1。

表1 2组大鼠给予STZ后不同时点空腹血糖及机械缩足阈值的比较±s

表1 2组大鼠给予STZ后不同时点空腹血糖及机械缩足阈值的比较±s

注:与 C 组比较，*P ＜0.05

组别 血糖(mmol/L)PWT(g)3周 5周 7周3周 5周 7周C 组(n=3) 5.7 ±0.9 5.8 ±0.8 5.9 ±0.9 11.0 ±3.1 10.4 ±2.7 10.7 ±2.6 D 组(n=5) 22.8 ±3.2* 22.7 ±2.8* 22.8 ±2.8* 3.3 ±1.0* 2.9 ±1.1* 2.8 ±1.8*

2.2 2组不同时点NR1与NR2B比较 与正常C组各时点比较，D组注射STZ后3周、5周、7周的糖尿病神经痛大鼠脊髓背角NR1和NR2B亚单位免疫阳性神经元细胞数明显增加(P＜0.05)。见表 2。

表2 2组大鼠给予STZ后不同时点脊髓背角NR1和NR2B亚单位表达的比较±s

表2 2组大鼠给予STZ后不同时点脊髓背角NR1和NR2B亚单位表达的比较±s

注:与 C 组比较，*P ＜0.05

组别NR1 3周 5周 7周NR2B 3周 5周 7周C组(n=3)31±13 32±12 31±12 40±4 43±4 42±6 D组(n=5) 81±13* 82±12* 72±12* 132±10* 109±17* 68±6*

2.3 细胞学检查 显微镜下观察，NR1和NR2B亚单位主要分布于细胞膜及胞浆。经DAB显色，使细胞膜及胞浆呈棕黄色，阳性细胞形状不规则，细胞膜及细胞浆均着色。见图1、2。

图1 2组大鼠脊髓背角NR1亚单位表达的免疫组化图

图2 2组大鼠脊髓背角NR2B亚单位表达的免疫组化图

3 讨论

本研究结果表明，D组给予STZ后不同时点机械缩足阈值＜4 g，且明显低于C组，提示DNP模型制备成功，DNP大鼠脊髓背角NMDA阳性细胞明显增加。

糖尿病作为一种代谢性疾病，可特异性地影响脊髓背根神经节、谷氨酸能神经元及其突触前膜(初级传入神经末梢)的GABAB(1A)亚基的表达和转运［5］。在DNP形成过程中，除了初级传入神经对DNP产生作用外，脊髓背角神经元过度兴奋(中枢敏化)也被认为是DNP的一种潜在机制［6，7］。谷氨酸是初级传入神经末梢释放的一种重要的兴奋性神经递质，在疼痛的形成过程中发挥重要作用。

本研究免疫组化结果显示:DNP组大鼠在STZ注射后5～7周脊髓背角NR1和NR2B亚基免疫阳性细胞数明显增多，与Edwards［8］等报道结果一致，原因为:蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)是疼痛信号传递过程中重要的钙依赖性第二信使［8］，长期慢性高血糖状态可激活PKC，PKC活化后会激活撕裂原活化蛋白激酶(MAPK)，从而引起转录因子磷酸化，继而改变基因表达，导致大鼠脊髓背角神经元NR1和NR2B亚基表达增多。DNP大鼠脊髓背角神经元释放兴奋性谷氨酸递质显著增加［9，10］，过度激活 NMDA 受体后，相偶联的 Ca2+，Na+，K+的通透性也随之增加，Ca2+内流增加，又加速了钙依赖性兴奋性氨基酸释放，从而引起脊髓的可塑性变化，使信号得以长时间维持，导致中枢敏感化。这种正反馈途径在持续性疼痛中的中枢敏化和神经元可塑性两方面具有重要的作用。GABAB受体也可通过磷酸化GABAB1受体亚型C末端867位点上的丝氨酸(S867)，活化兴奋性谷氨酸NMDA受体，该位点正是蛋白激酶C(PKC)作用的主要部位［11］。而本实验中DNP组大鼠自STZ注射后第3周，脊髓背角神经元NR1和NR2B阳性细胞显著增多，这种增多一直持续至第5周;而在STZ注射后低七周，DNP组大鼠脊髓背角NR1和NR2B阳性细胞有减少的趋势，这可能是:随着DNP的形成，谷氨酸持续释放和NMDA受体诱导的长时间的兴奋毒性导致细胞代谢功能障碍，诱发脊髓背角细胞凋亡［12，13］，可能使NMDA受体蛋白表达和mRNA转录明显降低，出现表达减少，这需要在以后的实验中延长观察时间。

本实验通过腹腔注射STZ诱导糖尿病神经痛大鼠模型，采用免疫组织化学染色观察正常对照组与实验组大鼠脊髓背角NMDA的表达变化，结果显示糖尿病神经病理性痛大鼠组脊髓背角NMDA受体的免疫阳性神经元量明显增多，这表明，NMDA受体在脊髓水平参与了糖尿病神经病理性痛的调节。

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