HPV E6/E7mRNA和HC2-HPV-DNA检测对宫颈病变筛查的意义

贾政军，周玉春，胡 蓉，彭向京，黄定梅，王 华，王 丹，何 思

(湖南省妇幼保健院遗传室，湖南 长沙 410008)

在世界范围内，子宫颈癌的发病率、死亡率位居妇女恶性肿瘤的第二位，严重威胁着人类的健康。早在1842年，Rogoni-stern[1]就推测宫颈癌的发生与性传播疾病有关。1974年，Zur hausen[2]首次提出人乳头瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌有密切关系，甚至是因果关系。迄今为止，已发现100多种型别的HPV，其中40多种已证实与人类生殖道感染有关[3]，其中与宫颈癌相关的最常见型别为HPV16型和HPV18型。

HPV是一类仅感染人皮肤、粘膜上皮细胞的双链环状DNA病毒，长约7.8-8Kb。能引起皮肤粘膜的多种增生性病灶，HPV感染后持续性刺激角化细胞，并提供有丝分裂增殖的肿瘤基因，持续表达而导致肿瘤的发生[4]。由于基因型不同，引起粘膜上皮细胞病理变化的类型也不同，其中HPV16、18、33、58等型与宫颈癌和上皮内瘤样变关系比较密切 （称高危型），HPV6、11型等病毒主要引起生殖器疣（称低危型）。高危型HPV的E6和E7蛋白通过与抑癌基因P53及视网膜母细胞瘤蛋白(RB)相互作用，参与宫颈癌的发生。目前，二代基因杂交捕获法 (hybrid capture II，HC2)检测高危型HPVDNA对宫颈癌及癌前病变的诊断具有重要的参考价值。本文旨在评价TCT和HC2-HPV-DNA检测在妇女宫颈癌前病变筛查工作中的应用价值，从而为这一群体的临床治疗及随访工作提供更有价值的信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008年1月至2011年11月湖南省妇幼保健院门诊病例、怀疑宫颈病变的187例女性为研究对象，年龄21～62岁，中位年龄37.8岁。所有研究对象均进行宫颈液基细胞学检查和用宫颈拭子获取脱落细胞进行HC2-HPV-DNA检测及病理活检。

1.2 方法

1.2.1 宫颈细胞病理学诊断

10%福尔马林固定标本，按1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小取材，分别用80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脱水2 h，用二甲苯溶解石蜡，使组织块充分浸入石蜡包埋，切片，厚度约为4～6 mm，常规HE染色，常规封片，根据病理诊断标准阅片。将组织标本区分为慢性宫颈炎、癌前病变 CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌。

1.2.2 TCT及诊断标准

将液基细胞塑料取材刷插入宫颈，顺时针方向旋转5～8圈，将官颈外口及宫颈管的脱落细胞装入液基细胞保存液中，按仪器操作说明自动制片，95%酒精固定，巴氏染色。诊断标准采用TBS(The Bethesda System)分级系统，即：无上皮内病变或恶性病变 (negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM)，意义不明的不典型鳞状细胞(atypical squamouseeHs of undetermined significance,ASCUS)，鳞状上皮内病变(squamous intraepithelial lesion,SIL)和鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma,SCC)。SIL包括鳞状上皮内低度病变 (low-grade squamous intraepithelial lesion,ISIL)和鳞状上皮内高度病变 (high-grade squmnous intraepithelial lesion,HSIL)。腺上皮不正常为意义不明的不典型腺细胞(atypical glandular cell of undetermined significance,AGUS)和腺癌。以炎症、ASCUS和LSIL为阴性，以AGUS、腺癌和HSIL为阳性。

1.2.3 HC2-HPV-DNA检测及诊断标准

标本采集均使用一次性取样器插入官颈管顺时针方向旋转5～8圈，取颈管分泌物装入特制保存液中，采用美国Digene公司提供的试剂盒，通过基因捕获技术(HC2)检测高危型人乳头瘤病毒(HPVDNA)16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、68，检测结果的诊断标准是RLU(相对光单位，光信号)/Cutoff(域值=三个阳性质控指标的平均值)≥1为阳性，

1.2.4 判定标准及评价方法

病理报告为CINl级/湿疣及以上病变者判为阳性，报告慢性炎者为阴性；TCT报告为LSIL及以上者定义为筛查阳性；HC2-HPV-DNA检测结果≥1即为筛查阳性；两者联合检测，TCT和HC2-HPV-DNA均阳性时定义为阳性，两者之中有一项阴性者或两项均阴性者定义为阴性。以病理学诊断结果做为金标准，计算TCT检测、HG2-HPV-DNA检测以及两种方法联合检测的敏感度、特异度、假阴性率、假阳性率、诊断符合率，做为评价检测方法的指标。

2 结果

2.1 病理诊断结果

在检测的187例宫颈组织中，阴性病变（宫颈炎）126例（67.38%），阳性病变（CINⅠ31 例，CINⅡ～Ⅲ 16例，宫颈癌14例）共61例（32.62%）。病理切片如图 1-1，1-2，1-3 所示。

图1 宫颈组织宫颈组织理诊断结果(HE染色×400)

2.2 检测结果

187例患者TCT、HC2-HPV-DNA与病理活检结果见表1。以病理学诊断结果做为金标准，计算TCT检测、HG2-HPV-DNA检测以及两种方法联合检测的敏感度、特异度、假阴性率、假阳性率、诊断符合率，发现HC2-HPV-DNA对绝经后妇女宫颈病变的筛查敏感性高于TCT检测，但其特异度明显低于后者，并且HC2-HPV-DNA检测的假阴性率要优于TCT检测；两者联合检测可明显降低假阳性率、提高诊断的特异度及诊断符合率(表2)。

表1 TCT、HC2-HPV-DNA与病理活检结果（例）

表2 TCT、HC2-HPV-DNA及两者联合检测的评价指标

3 讨论

自从1974年Zur Hausen提出人乳头状瘤病毒与宫颈癌发病有关的假设后，国内外学者就HPV感染与宫颈癌的关系进行了大量的研究[5]，报道称95%的宫颈癌患者合并有HPV感染[6]，1995年国际癌症研究协会 （IARC）专题讨论会认为，HPV感染是宫颈癌的主要病因。

HPV感染生殖道，可潜伏若干年，一旦机体免疫力降低，潜伏的病毒可恢复活动。HPV感染过程通常分为潜伏感染期、亚临床感染期、临床症状期和HPV相关的肿瘤期。宫颈癌也有一系列的前驱病变，即宫颈上皮不典型增生，在病理上称宫颈上皮内瘤变（CIN），通常又根据严重程度分成三级：宫颈上皮内轻度瘤变（CIN I）、宫颈上皮内中度瘤变（CIN II）和宫颈上皮内高度瘤变（CIN III），这些癌前病变均有可能发展为宫颈浸润癌。

在某些自然的或实验条件下，HPV病毒诱发的乳头状瘤虽具有转化为鳞状上皮细胞癌的倾向，然而并不是所有的HPV感染者和CIN都会发展为癌。对于大多数乳头状瘤，这种转化还需要其它辅助因子的存在，例如吸烟、化学物质、宿主（例如HIV感染）和环境因素等协同作用，对疣、乳头状瘤转为恶性肿瘤有致突变及启动作用。Nasiell[7]等人随访了555例病理诊断为CIN I的病人，平均随访时间为43月，发现62%的病人病情转归为正常，22%的病人病情维持原状，16%的病人病情进一步发展；对894例病理诊断为CIN II的病人随访65个月，结果54%的病人病情转归为正常，16%的病人病情维持原状，30%的病人病情进一步发展。

本实验结果显示，HC2-HPV-DNA对妇女官颈病变的筛查敏感性优于TCT检测，但其特异度明显低于后者。另外，HC2-HPV-DNA假阳性率较高，TCT检测假阳性率较HC2-HPV-DNA检测降低。本实验结果显示：两种方法检测结果可优势互补，联合应用，不仅可显著降低假阳性率，并且明显提高诊断的特异度及诊断符合率。

我们认为，要提高诊断符合率，最好做到以下几点。首先，要做好宫颈脱落细胞的取材、制片及细胞诊断的规范化培训工作，在宫颈癌筛查工作中，专业队伍或技术骨干的培训十分重要，对于任何筛选方案的落实都是决定性因素，筛查人员是否专业以及经验的多少、诊断水平的高低，对诊断标准的把握等均影响筛查效果。其次，注重多种筛查方法的联合应用，本实验结果显示：TCT及HC2-HPVDNA这两种筛查方法，均存在较高的误诊率及漏诊率，两种筛查方法联合应用，则明显提高诊断符合率[8]。因此，在做好宫颈癌筛查规范化培训工作的同时，尽可能联合应用TCT及HC2-HPV-DNA这两种筛查方法，提高诊断符合率，最大程度降低假阳性及假阴性率，切实提高诊断的准确性，以免遗漏严重病变及减少不必要的阴道镜检查及病理活检的痛苦。

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