幽门螺杆菌对胃癌BGC－823细胞中Bcl－xl基因表达的影响及作用＊

吴 莺，孙海波，艾宽宽，何亚龙，魏金文，徐 岷，周 红

（1.江苏大学附属医院消化科，江苏镇江212001；2.江苏大学医学基础与医学技术学院，江苏镇江212001）

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）与胃癌的发生密切相关，其致癌机制仍不十分明确［1］。体内及体外的研究显示，Hp可以刺激胃上皮细胞的增殖［2］。Bcl－xl基因是一种抗凋亡基因，研究显示，Bcl－xl基因在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用［3－4］。RNA干扰技术是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。本研究用东亚型（W24）及西方型（11637）［两种菌株均为cagA阳性（＋）菌株］Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，探讨Hp超声裂解液对胃癌BGC－823细胞增殖以及胃癌BGC－823细胞中Bcl－xl基因mRNA表达水平的影响，设计Bcl－xl基因特异性shRNA沉默Bcl－xl基因的表达，从而抑制胃癌BGC－823细胞增殖，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃上皮细胞BGC－823细胞由江苏大学生理教研室提供；东西方型Hp（均为cagA＋菌株）来源于江苏大学附属医院消化科［5］。Hp培养相关材料试剂购于德国 Merck公司；Bcl－xl shRNA Plasmid（h）以及Bcl－xl单克隆抗体购于Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BGC－823于含10%新生小牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2温箱中培养。

1.2.2 Hp培养及菌体超声裂解液的制备 将Hp接种于哥伦比亚固体琼脂培养基，加入10%的新鲜羊血，在微需氧环境，37℃下培养，3d后收集细菌，经鉴定为Hp菌株，然后将Hp刮下后用PBS漂洗2次，悬于不含血清的DMEM培养液中，菌体悬液经超声裂解后浓度调整为（1g／L），－20℃保存备用［6］。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取1×103／mL细胞悬液接种于96孔培养板内，待细胞贴壁后吸去培养基，实验组分别加入含10%的东亚型和10%的西方型Hp超声裂解液的培养基，并设置5个平行孔；对照组为不含Hp的裂解液成分培养基，并设置5个平行孔；继续培养24h。参照MTT步骤，于490 nm波长测定吸光度值（OD值）。细胞的增值率（%）＝OD（实验组－对照组）／OD对照组×100%。

1.2.4 荧光定量PCR检测Bcl－xl mRNA水平表达 取1×105／mL细胞悬液接种于6孔培养板内，37℃、5%CO2温箱中培养，待细胞贴壁后，吸去培养基，实验组分别加入含10%的东亚型和10%的西方型Hp超声裂解液的培养基，对照组为不含Hp的裂解液成分培养基，继续培养24h。提取胃癌BGC－823细胞总RNA，证实提取的总RNA可用（图1）。按照逆转录试剂盒说明书，将细胞的总RNA逆转录成cDNA。引物的设计与合成：上游引物 P1：5′－TGG CAG CAG TAA AGC AAG－3′；下游 引物 P2：5′－CAT TTC CGA CTG AAG AGT GA－3′（GenBank登录号：NM＿138578.1），引物由公司合成。引物的长度为137bp。反应体系参照说明书。内参为GAPDH，引物长度为496bp。每个反应至少重复3次。

图1 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，细胞总RNA的凝胶电泳图

1.2.5 细胞转染 取每毫升3×105细胞悬液接种于6孔培养板内，培养使细胞达到90%～95%的融合。溶液1：在6孔培养板每孔加入无血清DMEM培养基240μL和10μL的脂质体2000（总体积250μL，温育5min）；溶液2：Bcl－xl shRNA Plasmid DNA 2μg溶于250μL的无血清DMEM培养基中；空白照为250μL的无血清DMEM培养基；阴性对照为2μg Control shRNA Plasmid DNA溶于250μL的无血清DMEM培养基中。参照说明书转染。转然后继续培养24～72h检测转染水平。

1.2.6 转染水平检测

1.2.6.1 荧光定量PCR检测Bcl－xl mRNA水平表达 转然后24h，提取细胞总RNA，反转录成cDNA进行荧光定量PCR检测（方法如1.2.4）。

1.2.6.2 蛋白印迹法 提取转染后72h的细胞的总蛋白，蛋白上样量为10μL，将蛋白于Bio－Rad标记的转印仪上转移至PVDF膜上，BSA封闭，Bcl－xl单抗、山羊抗鼠IgG孵育，发光剂孵育5min后于成像系统上扫描，以β－actin为内参，测定其比值。

1.2.6.3 转然后MTT法检测细胞增殖 转染24h后以每孔1×103个细胞接种于96孔培养板，每孔终体积为200μL。培养24h后换液开始实验。分别在24、48h和72h3个时间段测OD。

1.3 统计学处理 用SPSS16.0统计软件进行检验，实验数据均以±s表示。多个均数间比较，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hp超声裂解液促进胃癌BGC－823细胞增殖 与对照组相比，东亚型处理组细胞增值率为29.7%（P＜0.01），西方型处理组细胞增值率为18.7%（P＜0.01）；与西方型处理组相比，东亚型处理组细胞增值率为11%（P＜0.01）。见图2。

图2 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，MTT法检测细胞增殖情况

图3 Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞24h后，荧光定量PCR检测细胞中Bcl－xl mRNA水平的表达

图4 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝胶电泳图

图5 Bcl－xl shRNA转染BGC－823细胞24h后，Bcl－xl mRNA的相对表达量（%）

2.2 Hp超声裂解液可以上调BGC－823细胞中Bcl－xl mRNA水平的表达 与对照组相比，东亚型处理组细胞中Bcl－xl mRNA水平上调了2.39倍（P＜0.01），西方型处理组细胞中Bclxl mRNA水平上调了2.06倍（P＜0.01）；与西方型处理组相比，东亚型处理组细胞中Bcl－xl mRNA水平表达量更高（P＜0.05。见图3、4。

图6 Bcl－xl基因RT－PCR后的2%凝胶电泳图

图7 Bcl－xl shRNA 转染 BGC－823细胞72h后，Bcl－xl蛋白的相对表达量的变化

图8 Bcl－xl shRNA 转染 BGC－823细胞72h后，Bcl－xl蛋白的相对表达量的变化

图9 Bcl－xl shRNA分别转染BGC－823细胞24、48h及72h后，MTT法检测BGC－823细胞的增殖情况

2.3 Bcl－xl shRNA 可以沉默Bcl－xl mRNA、蛋白的表达，并抑制BGC－823细胞的增殖 转染24h后，Bcl－xl mRNA水平明显的下调（图5、6）。转染72h后，Bcl－xl蛋白表达水平也明显下调（图7、8）。转染24、48h和72h后，BGC－823细胞的增殖抑制率分别为7.5%、24.7%、53%（均为P＜0.01），见图9。

3 讨 论

Hp的毒力因子CagA蛋白与胃癌的发生密切相关［7－8］。CagA蛋白主要有东亚型和西方型2种类型。研究显示，东亚型CagA＋Hp与胃癌的发生关系更密切［9］。在本研究中，分别用东亚型和西方型CagA＋Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，与对照组相比，处理组细胞均出现增殖，且东亚型处理组细胞增殖更显著，提示东亚型CagA＋Hp比西方型CagA＋Hp具有更强的生物活性。Bcl－xl是一种抗凋亡基因，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。在线粒体凋亡途径中，Bcl－xl通过抑制线粒体细胞色素C的释放，从而影响凋亡复合体的组装而发挥抗凋亡作用；在细胞表面的死亡受体介导的凋亡途径中，Bcl－xl通过阻碍死亡复合体（DISC）的组装而发挥抗凋亡作用。Nardone等［10］临床标本研究发现，Hp阳性患者中Bcl－xl基因的表达显著高于 Hp阴性的患者中Bcl－xl基因的表达。Yang等［11］临床标本研究发现，CagA＋Hp患者中Bcl－xl基因的表达显著高于CagA－Hp的患者中Bcl－xl基因的表达。这说明Hp与Bcl－xl基因的表达有一定的相关性，且与CagA毒力因子有关。本研究分别用东亚型和西方型CagA＋Hp超声裂解液处理胃癌BGC－823细胞，与对照组相比，处理组细胞均出现增殖，细胞中Bcl－xl mRNA的表达均出现上调，这提示Bcl－xl与胃癌BGC－823细胞的增殖有一定相关性。RNA干扰技术已广泛应用于肿瘤的治疗研究中［12－13］。许多体外研究也表明，Bcl－xl特异性干扰RNA可以抑制人类肿瘤细胞的增殖［14－15］。因此本研究用Bcl－xl特异性干扰RNA转染胃癌BGC－823细胞，观察其对胃癌BGC－823细胞的增殖的影响。将特异性Bcl－xl shRNA质粒转染胃癌BGC－823细胞，结果胃癌BGC－823细胞中Bcl－xl mRNA的表达以及蛋白的表达均显著降低，并且胃癌BGC－823细胞的增殖作用也有不同程度的降低。这说明胃癌BGC－823细胞的增殖与Bcl－xl基因的表达确有一定相关性。

本研究结果显示，Bcl－xl基因在Hp感染相关性胃癌中扮演着重要的作用，尤其在CagA＋Hp感染相关性胃癌中所起的作用更显著，Bcl－xl特异的干扰RNA可以抑制胃癌shRNA细胞的增殖。因此，Bcl－xl特异的干扰RNA或许可以作为治疗胃癌的方法。

［1］ Nagy TA，Wroblewski LE，Wang D，et al.β－Catenin and p120mediate PPARδ－dependent proliferation induced by Helicobacter pylori in human and rodent epithelia［J］.Gastroenterology，2011，141（2）：553－564.

［2］ Wang F，Pan J，Luo L，et al.Chronic Helicobacter pylori infection induces the proliferation and apoptosis in gastric epithelial cells and gastric precancerosis in Mongolian gerbils［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao：Yi Xue Ban，2011，36（9）：865－871.

［3］ Chan SL，Yu VC.Proteins of the bcl－2family in apoptosis signalling：from mechanistic insights to therapeutic opportunities［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31（3）：119－128.

［4］ Kang MH，Reynolds CP.Bcl－2inhibitors：targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy［J］.Clin Cancer Res，2009，15（4）：1126－1132.

［5］ 吴莺，张尤历，王文兵，等.不同地区幽门螺杆菌cagA基因羧基端可变区及其蛋白EPIYA基序的研究［J］.世界华人消化杂志，2007，15（27）：746－749.

［6］ Chen YC，Wang Y，Li JY，et al.H pylori stimulates proliferation of gastric cancer cells through activating mitogenactivated protein kinase cascade［J］.World J Gastroenterol，2006，12（37）：5972－5977.

［7］ Tanaka H，Yoshida M，Azuma T.The role of CagA in H.pylori infection［J］.Nihon Rinsho，2009，67（12）：2245－2249.

［8］ Murata－Kamiya N.Pathophysiological functions of the CagA oncoprotein during infection by Helicobacter pylori［J］.Microbes Infect，2011，13（10）：799－807.

［9］ Yamaoka Y，Osato MS，Sepulveda AR，et al.Molecular epidemiology of Helicobacter pylori：separation of H.pylori from East Asian and non－Asian countries［J］.Epidemiol Infect，2000，124（1）：91－96.

［10］Nardone G，Rocco A，Vaira D et al.Expression of COX－2，mPGE－synthase1，MDR－1（P－gp），and Bcl－xL：a molecular pathway of H pylori－related gastric carcinogenesis［J］.J Pathol，2004，202（3）：305－312.

［11］Yang GF，Deng CS，Xiong YY，et al.Expression of nuclear factor－kappa B and target genes in gastric precancerous lesions and adenocarcinoma：association with Helicobactor pylori cagA（＋）infection［J］.World J Gastroenterol，2004，10（4）：491－496.

［12］Uprichard SL.The therapeutic potential of RNA interference［J］.FEBS Lett，2005，579（26）：5996－6007.

［13］Campeau E，Gobeil S.RNA interference in mammals：behind the screen［J］.Brief Funct Genomics，2011，10（4）：215－226.

［14］Yang J，Sun M，Zhang A，et al.Adenovirus－mediated siRNA targeting Bcl－xL inhibits proliferation，reduces invasion and enhances radiosensitivity of human colorectal cancer cells［J］.World J Surg Oncol，2011，9：117.

［15］Mu P，Nagahara S，Makita N，et al.Systemic delivery of siRNA specific to tumor mediated by atelocollagen：combined therapy using siRNA targeting Bcl－xL and cisplatin against prostate cancer［J］.Int J Cancer，2009，125（12）：2978－2990.