大肠癌Cyclin D1多态性及相关细胞周期蛋白表达的研究

任 鸿

（山西中医学院附属医院外科，山西太原030024）

大肠癌Cyclin D1多态性及相关细胞周期蛋白表达的研究

Polymorphism of Cyclin D1 and Expression of Cell Cycle Related Genes in Colorectal Carcinoma

任 鸿

（山西中医学院附属医院外科，山西太原030024）

目的：研究大肠癌中Cyclin D1基因DNA序列的多态性及其相关的细胞周期调控蛋白的表达水平。方法：取55例大肠癌患者手术切除标本，抽提病变组织中的基因组DNA，另取24例非癌症切除的正常组织作为正常对照。通过PCR扩增Cyclin D1的4号外显子的基因组DNA片段，并进行限制性片段长度多态性分析，统计Cyclin D1第242号密码子多态性的分布比例。以Western Blot方法，在蛋白质水平检测相应组织中Cyclin D1，Cdk6和pRb的表达水平及磷酸化水平。将检测结果以光密度值进行半定量，对比各组不同的Cyclin D1基因型对相关蛋白表达的影响。结果：在55例大肠癌中，有12例（21.8%）的基因型显示为GG；有24例（43.6%）的基因型显示为AG；有19例（34.5%）的基因型显示为AA。当其基因型为AA和AG时，Cyclin D1表达水平和pRb磷酸化水平要显著高于基因型为GG的标本（P<0.01）。一般GG型的肿瘤组织中Cyclin D1的表达水平和pRb磷酸化水平与正常组织无显著性差异；而AA和AG型的肿瘤组织中，Cyclin D1的表达水平则分别可以达到正常组织的（4.87±2.38）倍和（3.43±1.74）倍。病理学检测显示多数AA和AG型大肠癌的肿瘤分级也显著高于GG型的标本（P<0.05）；但肿瘤分期的差异无统计学意义（P>0.05）。结论：大肠癌中Cyclin D1基因第242号密码子具有多态性。Cyclin D1的等位基因多态性在很大程度上影响了pRb的磷酸化水平，与大肠癌病理分级以及预后有密切联系。

大肠癌；细胞周期素D1；等位基因；多态性

Cyclin D1属于细胞周期调节蛋白，在调控正常细胞周期过程中起重要作用［1］。当其基因突变引起过度表达时，往往有助于肿瘤的形成［2］，特别是发生了G→A转换的Cyclin D1基因所表达的蛋白质具有更长的半衰期，使其在细胞内的作用时间延长，破坏了细胞周期的平衡［3］。本研究对大肠癌组织中Cyclin D1基因多态性进行分析，并检测Cyclin D1基因的表达及其相关的细胞周期调控蛋白的水平，阐明Cyclin D1基因对大肠癌的影响。

1 资料与方法

1.1 DAN抽提及PCR扩增

取55例大肠癌手术标本，另取24例非癌组织作为对照。各取50 mg组织抽提基因组DNA。各取100 ng DNA样品通过PCR反应扩增目的片段。引物 ：5′-GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-3′和 5′-GGGACATCACCCTCACTTAC-3′，退火温度57℃，产物片段的长度为167 bp。

1.2 Cyclin D1基因多态性的检测

扩增产物交由上海生工进行测序，以确定扩增产物为本研究所需的片段，并对癌变组织和正常组织的测序结果进行比对和统计。然后，进行限制性片段长度多态性分析，以5个单位的限制性内切酶ScrFI（New England），于37℃酶切上述PCR产物过夜，随后在3%Agarose凝胶（含0.5 mg/L Ethidium Bromide，EB）中进行电泳，根据酶切产物的不同条带，统计各组基因型的比例。

1.3 Western Blot检测Cyclin D1、Cdk6和pRb的表达水平及磷酸化水平

取各组标本100 mg充分剪碎，研磨成糜状，置于1 mL蛋白裂解液充分裂解。Bradford法测定样品中的蛋白含量，将所有样品的蛋白含量稀释至等浓度。取15 μL蛋白样品与15 μL上样液混匀，沸水浴15 min，上样至8%的SDS-PAGE，10 mA电泳约4 h。电泳完毕，取下凝胶，蛋白条带电转膜至硝酸纤维素膜，80 V约2 h，硝酸纤维素膜置于封闭液（Pierce）中，4℃过夜。次日，分别加入鼠抗Cyclin D1、鼠抗Cdk6 和鼠抗 pRb（NeoMarker Inc）；然后再加生物素化二抗，碱性磷酸酯酶联三抗，摇床震荡1.5 h，充分反应，使之互相结合，最后加入显色底物NBT-BCIP（Pierce），在酶催化作用下，显色于硝酸纤维素膜。通过Quantity One software（BIO-RAD）软件对各组条带，扫描拍照；并对其光密度值进行半定量分析。

1.4 病理学分析

有病理科2名高级医师对各例大肠癌组织进行切片病理学分析，将病理分级和分期的结果与各自测得的基因型对照，观察Cyclin D1多态性对肿瘤组织的病理学分级和分期的影响。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 Cyclin D1基因多态性的分布

Cyclin D1基因第242号密码子等位基因是A的片段未能被ScrFI所酶切，长度仍然是167 bp；等位基因是G的片段被ScrFI所酶切，成为2个小片段，长度分别是146 bp和21 bp。在55例大肠癌患者中，Cyclin D1基因第242号密码子有34.5%的基因型显示为AA，显著高于正常对照组的20.8%（P<0.01）。在大肠癌患者中，等位基因是A的占56.4%，等位基因是G的占43.6%；而正常对照组中，等位基因是A的占43.8%，等位基因是G的占56.2%。由此可见，Cyclin D1基因第242号密码子的A/G多态性，显著影响基因携带者对大肠癌的易感性（见图1）。

图1 Cyclin D1基因的PCR限制性片段长度多态性检测

2.2 Cyclin D1在不同基因型的大肠癌中的表达水平

在Cyclin D1第242号密码子，基因型为AA和AG的大肠癌中，Cyclin D1蛋白的表达水平，分别达到正常组的（4.87±2.38）倍和（3.43±1.74）倍；均显著高于基因型为GG的组织（P<0.01）。而GG型组织中Cyclin D1蛋白的水平，仅比正常组略高一些，差异无统计学意义（见图2）。

图2 Cyclin D1蛋白的表达水平

2.3 Cdk6和pRb的表达水平及磷酸化水平

所有大肠癌表现Cdk6高水平表达，平均达到正常组的（2.54±1.09）倍。但是Western Blot半定量结果没有发现Cyclin D1基因多态性对Cdk6的表达水平没有影响（见图3）。

Western Blot检测pRb的结果可见两条带，一条分子量较大的代表磷酸化pRb，另一条分子量较小的条带为去磷酸化pRb。结果显示pRb的磷酸化状态与Cyclin D1基因多态性有密切的关系（P<0.01），基因型为AA和AG的大肠癌中，Western Blot显示有明显的磷酸化pRb条带，而GG型组织中磷酸化pRb条带基本不可见，与正常组类似，比较差异无统计学意义。

图3 Cdk6和pRb的蛋白表达水平

2.4 Cyclin D1基因多态性对肿瘤组织病理学的影响

对所有55例大肠癌患者的癌变组织进行病理学分析，Cyclin D1基因多态性与肿瘤病理分级具有明显的相关性（P<0.05），在GG和AG型组织中以Ⅰ、Ⅱ级为主，在AA型组织中则Ⅲ级较多，其间的差别有显著性（P<0.05）。但是，在低分期组（Ⅰ、Ⅱ）与高分期组（Ⅲ、Ⅳ）之间，Cyclin D1基因多态性的影响并不具有统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

Cyclin D 是一种原癌基因［4］。Cyclin D1 基因 4号外显子的第242号密码子有A/G多态性，使其转录产物mRNA发生不同位点的剪接。这2种不同剪接方式形成的mRNA所合成的蛋白质都带有正常生物学功能的Cyclin区（第55～161号氨基酸），但是在G→A转换时，羧基端原有的55个由5号外显子编码的氨基酸缺失，转而由4号内含子编码的44个氨基酸的肽段所取代［3］。由于缺失的片段中，包含了富含PEST的降解相关区域，就造成了Cyclin D1蛋白质代谢过程紊乱，具有了更长久的半衰期［5-6］。对不同肿瘤检测发现，Cyclin D1基因的G→A转换会导致基因携带者有罹患癌症的倾向［7］。本研究55例大肠癌患者中，Cyclin D1基因第242号密码子有34.5%的基因型为AA，显著高于正常对照组20.8%（P<0.01），可见Cyclin D1的A/G多态性显著影响患者对大肠癌的易感性。

对Cyclin D1基因的这一多态性进行深入研究，在蛋白水平的检测显示，基因型为AA和AG的大肠癌中，Cyclin D1蛋白的表达水平，均显著高于基因型为GG的癌症组织（P<0.01）。据此推测，Cyclin D1在G→A转换时，缺失了降解相关的PEST区域，增加了Cyclin D1蛋白在细胞内的稳定性，因此AA和AG基因型的癌症组织里，其表达水平会显著高于GG基因型。

Cyclin D1可以与Cdk4和Cdk6形成复合体，从而使级联的信号分子，如Rb基因的蛋白产物pRb等发生磷酸化。未磷酸化的pRb与E2F家族的转录因子结合，阻遏细胞周期的进行；当它磷酸化之后，就会解除这种抑制作用，引导细胞进入S期［8］。我们也对其中，与Cyclin D1关系密切的几种细胞周期调控蛋白进行了检测。Cdk6的表达在所有基因型的大肠癌组织中，均有高水平表达。而pRb的磷酸化状态则与Cyclin D1基因多态性有密切的关系（P<0.01），在基因型为AA和AG的大肠癌中，有明显的磷酸化pRb条带；GG型组织中磷酸化pRb条带基本不可见，类似正常对照组。pRb为重要的细胞周期负调控因子，是G1→S调控点的中心，pRb的磷酸化是Rb基因调节细胞生长分化的主要形式。当由于上游Cyclin D1的表达异常，致使过量的Rb发生磷酸化时，就会有过多的细胞进入自主分裂，逃避凋亡程序，最终形成组织异常增生或者局部的过度血管化［9］。本研究中对癌变组织进行的病理学分析，也证实了上述观点。Cyclin D1基因多态性与肿瘤病理分级具有明显的相关性（P<0.05），在GG和AG型组织中以Ⅰ、Ⅱ级为主，在AA型组织中则是Ⅲ级的比例较高，其间的差别有显著性（P<0.05）。有研究报道，在其他肿瘤类型中，Cyclin D1过表达的癌症患者容易发生某些耐药倾向或者有较差的预后［10］；通过基因治疗的手段，下调Cyclin D1的表达，不仅可以改变细胞的周期，还发现可以明显抑制耐药细胞中多种耐药基因的表达，提高细胞对化疗药物的敏感性，改善化疗的效果［11］。但是，在低分期组（Ⅰ、Ⅱ）与高分期组（Ⅲ、Ⅳ）之间，Cyclin D1基因多态性的影响并不具有显著性（P>0.05）。癌症是经过多基因、多步骤，逐步形成的［12］，可见在肿瘤分期这一方面，Cyclin D1基因并非是主要因素，而由其他的癌基因所控制。

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R657.1

A

1671-0258（2012）04-0057-03

任鸿，女，副主任医师，从事外科临床工作

2012-05-01