LY294002联合顺铂对脑胶质瘤U87细胞株增殖的影响＊

李 焘，万志先，罗 然，王雄伟△，曾 晖，刘朝奇，汪 雷，王 炜，孙 丽

（1.武汉科技大学附属普仁医院神经内科，武汉430081；2.三峡大学神经病学研究所／宜昌市中心人民医院神经外科，湖北宜昌443003；3.三峡大学分子生物研究所，湖北宜昌443003）

LY294002联合顺铂对脑胶质瘤U87细胞株增殖的影响＊

李 焘1，万志先2＃，罗 然2，王雄伟2△，曾 晖2，刘朝奇3，汪 雷2，王 炜2，孙 丽3

（1.武汉科技大学附属普仁医院神经内科，武汉430081；2.三峡大学神经病学研究所／宜昌市中心人民医院神经外科，湖北宜昌443003；3.三峡大学分子生物研究所，湖北宜昌443003）

目的体外观察磷酸肌醇－3激酶（PI3K）特异性抑制剂LY294002与顺铂（CDDP）联合对人脑胶质瘤U87细胞株增殖的抑制作用。方法采用细胞毒实验（MTT）法、流式细胞术（FCM）检测LY294002单独或联合CDDP对人脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用，并观察细胞形态学变化。结果LY294002与CDDP均能抑制U87细胞生长，呈剂量依赖性，两者联合有协同效应。当CDDP为0.625μg／mL和LY294002为5μmol／L时达到最大协同作用（Q＝1.21），FCM检测细胞被阻滞在G1期，S期细胞比例减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论LY294002能有效提高神经胶质瘤U87细胞对CDDP的敏感性，本研究为两种化疗药物在临床上的联合应用提供了理论依据。

神经胶质瘤；药物疗法；顺铂；LY294002；增殖抑制

神经胶质瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤，单一的手术切除难以治愈，化疗是术后的主要辅助治疗手段，以顺铂为主的联合化疗是多种肿瘤的一线治疗方案，它可以联合多西他赛、依托泊苷、吉西他滨等治疗非小细胞肺癌、食管小细胞癌和乳腺癌［1－3］。磷脂酰肌醇－3 激 酶／丝 氨 酸－苏 氨酸蛋白 激 酶（PI3K／Akt）信号转导通路被认为是肿瘤细胞存活的首要通路，与LY294002是PI3K特异性抑制剂，近年研究表明LY294002可以增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗作用［4－6］。但LY294002联合顺铂（CDDP）对人胶质瘤 U87细胞生长的影响未见报道。本研究以胶质瘤细胞株U87为研究对象，观察LY294002和CDDP对U87细胞增殖的抑制作用及细胞形态的变化，为临床增强神经胶质瘤化疗疗效提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 脑胶质瘤细胞株U87由自华中科技大学附属同济医院神经外科实验室惠赠。在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中用含10%胎牛血清（美国Sigma公司）的RPMI－1640培养基（美国Sigma公司）培养，2～3d更换1次培养液，待细胞融合达80%时即消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 主要试剂 LY294002粉剂购自美国Cayman公司，CDDP购自齐鲁制药有限公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）细胞增殖分析试剂为Promega公司产品。全波长酶标仪为Thermo公司产品。Epics XL－4流式细胞仪（FCM）为Beckman Coulte公司产品。Eclipes TE2000－S倒置荧光显微镜为日本尼康公司产品。

1.3 方法

1.3.1 细胞毒实验（MTT）法检测细胞的增殖抑制率 取对数生长期细胞，调整到所需细胞浓度，接种于96孔培养板（100微升／孔），置于培养箱中培养24h。实验分组如下：（1）LY294002组分别按浓度梯度给药浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0μmol／L；（2）CDDP组分别按浓度梯度给药0.315、0.625、1.250、2.500、5.100μg／mL；（3）联合用药组分别加入上述两种药物，两药相应浓度以1∶1相互组合。以上3组为实验组，每个浓度设3个复孔。设实验对照组和空白对照孔（对照组）。给药后继续置于5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养48h，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，微量振荡器震荡10min，用酶联免疫检测仪检测波长在570nm的吸光度（A值）。实验重复3次，均设3个复孔，取3个复孔的均值为最终结果。按以下公式计算各组细胞的增殖抑制率（IR）。IR＝（1－实验孔A／对照孔A）×100%。按金正均提出的概率和法计算Q值并判断两药的协同作用［7］。Q＝E（A＋B）／［EA＋（1－EA）×EB］，其中E（A＋B）为两药联合应用时的细胞增殖抑制率，EA和EB分别为两药单独应用时的细胞增殖抑制率。当Q为0.85～1.15时，表示两药作用相加；当Q＞1.15时，表示两药作用协同；当Q＜0.85时，表示两药相互拮抗。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡 选取Q＞1.15即CDDP 0.625μg／mL，LY294002 5μmol／L单用或联合48h作为药物实验组。细胞悬浮磷酸盐缓冲液（PBS）中，1 000r／min，离心10min，去上清液，调整细胞数至2×106，细胞悬液用70%的冰乙醇固定，4℃固定过夜，离心去除固定液，PBS清洗1次，RNA酶37℃处理1h，与碘化丙啶（PI）在37℃反应30min，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.3.3 细胞形态学观察 用6孔培养板接种细胞过夜，分别用LY294002与CDDP单独和联合作用U87细胞48h后，用倒置荧光显微镜观察培养板中U87细胞用药前后的形态变化。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量数据以±s表示。同一药物不同浓度组间采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD－t检验，α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度LY294002和CDDP单药及联合用药对胶质瘤U87细胞的抑制作用 LY294002和CDDP对U87细胞体外生长有明显的抑制作用（封2图1），其抑制率呈剂量依赖关系（P＜0.01），两者联合抑制作用增加（P＜0.05），见表1。经计算Q值显示，两种药物联合均有相加作用；LY294002和CDDP浓度分别为0.625μg／mL和5μmol／L时具有协同作用（P＞1.15），见表2。

表1 LY294002与CDDP单用或者联合48h对U87细胞的增殖抑制作用（n＝3，±s）

表1 LY294002与CDDP单用或者联合48h对U87细胞的增殖抑制作用（n＝3，±s）

＊：P＜0.01，组内比较；○：P＜0.05，与单药组比较。

组别 剂量 抑制率（%）对照组LY294002（μmol／L） 2.500 0 16.3±1.3＊5.000 0 23.1±1.0＊10.000 0 31.6±2.1＊20.000 0 35.4±1.1＊40.000 0 47.1±2.2＊80.000 0 52.8±1.0＊CDDP（μg／mL） 0.312 5 19.7±2.1＊0.625 0 27.0±1.5＊1.250 0 47.7±1.6＊2.500 0 60.1±1.4＊5.000 0 68.5±1.2＊10.000 0 75.4±2.7＊LY294002联合CDDP（μmol／L、μg／mL） 2.5＋0.312 5 35.0±1.3＊○5.0＋0.625 0 51.4±2.1＊○10.0＋1.250 0 56.2±1.3＊○20.0＋2.500 0 66.4±1.2＊○40.0＋5.000 0 76.1±2.4＊○80.0＋10.000 0 80.3±1.8＊○

表2 LY294002联合CDDP作用48h胶质瘤U87细胞的Q值

2.2 流式细胞术分析 根据MTT实验结果，选取Q值最大的CDDP和LY294002浓度，即CDDP 0.625μg／mL，LY294002 5 μmol／L单用或联合48h作为药物实验组。LY294002和CDDP单用或联用均表现改变细胞周期的活性，两药联合作用G1期细胞比例较单药组增加更明显，S期减少（P＜0.01），而G2期比例变化不大，见表3。

表3 LY294002联合CDDP 48h对U87细胞周期的影响（n＝3，±s）

表3 LY294002联合CDDP 48h对U87细胞周期的影响（n＝3，±s）

＊：P＜0.01，与对照组比较；▲：P＜0.01，与单药组比较。

组别细胞周期分布（%）G0／G1 S G2／M对照组48.3±3.1 45.0±2.9 6.7±1.7 LY294002组 64.3±2.3＊ 29.1±1.8＊ 6.5±2.2 CDDP组 66.2±2.8＊ 27.0±2.5＊ 6.8±2.6联合用药组 73.4±2.1＊▲ 19.6±1.7＊▲7.4±1.8

2.3 细胞形态 倒置显微镜下，对照组U87细胞呈单层生长，生长密度大，呈梭形或三角形，核分裂相多，实验组经LY294002或CDDP处理后，胶质瘤细胞逐渐减少，体积变小，胞质透亮度下降，颗粒感增强，细胞突触变短、变圆，部分细胞胞突回缩变圆，脱落呈悬浮状，而CDDP联合LY294002用药处理的细胞，上述变化更加显著，并可见细胞形态破坏，胞膜破裂，细胞凋亡。

3 讨 论

神经胶质瘤约占颅内原发恶性肿瘤的40%，胶质母细胞瘤（GBM）是神经胶质瘤中一种最常见的、恶性程度最高的一种类型，预后极差，超过90%的GBM是原发性GBM，绝大部分患者在确诊后的生存期只有1年，2年生存期的患者小于10%［8］，目前主要采取以手术切除为主、放化疗为辅的综合治疗。

在体外试验中，所有化疗药物在高剂量时均会对肿瘤生长有抑制作用，但是，某种化疗药物能否成功运用于临床的关键是其疗效与毒性剂量之间的安全范围，如何上调肿瘤细胞对化疗的敏感性至关重要。化疗敏感性由肿瘤细胞的固有耐药和化疗中的获得性耐药决定，肿瘤细胞对化疗药物的固有耐药不能改变，只能通过调节获得性耐药增强化疗药物的敏感性。CDDP广泛运用于临床，为铂的金属络合物，作用似烷化剂，主要作用靶点为DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成DDPDNA复合物，干扰DNA复制，或与核蛋白及胞浆蛋白结合，研究发现CDDP可以激活多种信号转导通路，包括Fas／FasR、ATR、p53及MAPK信号通路，最终通过活化Caspase－3促进细胞凋亡［9］。

PI3K／Akt细胞转导通路被认为是肿瘤细胞存活的首要通路，与肿瘤的发生、发展密切相关，在肿瘤细胞恶性增殖、转移以及对放、化疗的拮抗起着重要作用［10］。近年来应用信号通路靶点抑制剂与放、化疗结合治疗的方法，为肿瘤的治疗开辟了一条新的途径，日益受到癌症研究者得重视。研究发现，磷酸化的Akt可以将Bad磷酸化，磷酸化的Bad失去与Bcl－XL结合的能力，恢复了Bcl－2的抗凋亡能力，通过控制细胞色素C从线粒体的释放来介导Csapases家族的活性［11］。Fujiwara等［12］发现，CDDP可以诱导胰腺癌细胞中 Akt活化，LY294002通过抑制Akt和Bad的磷酸化，上调Caspase－3的表达，从而增加了胰腺癌AsPC－1、PANC－1细胞对CDDP的敏感性，并在动物实验中得到证实。Asechi等［13］认为，survivin的表达上调介导了大鼠肝癌细胞K－251对CDDP的耐药，LY294002通过抑制survivin的表达增加肿瘤细胞对CDDP的敏感性。

本研究主要探讨LY294002联合CDDP是否可以增强对神经胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用，以期改善化疗药物对预防脑胶质瘤术后复发的效果。本研究发现，在体外环境下LY294002联合CDDP能增强对胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用。当 LY294002浓度为5μmol／L、CDDP 0.625μg／mL时，联合用药存在协同作用（Q＝1.21），说明LY294002有增加CDDP治疗效果的作用。FCM结果表明，用相同剂量的CDDP作用U87细胞，在LY294002干预后，G1期细胞比例增加，S期细胞减少，G2期变化不大。本研究发现，LY294002和CDDP单药组可以抑制细胞增殖，联合用药组抑制作用更加明显。

总之，本研究已证实LY294002和CDDP能协同抑制人胶质瘤细胞株U87增殖，但LY294002增强胶质瘤对CDDP敏感性的分子机制尚未明确，有待进一步研究。

［1］申洁，贺外信.多西他赛联合顺铂治疗非小细胞肺癌近期疗效观察［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（1）：68－69.

［2］刘莺，曹婧，张艳玲，等.依托泊甙联合顺铂治疗食管小细胞癌的疗效［J］.肿瘤防治研究，2011，38（12）：1423－1425.

［3］王蓓，王淅，吕晓皑.吉西他滨联合顺铂一线治疗晚期三阴乳腺癌疗效分析［J］.实用肿瘤杂志，2011，26（5）：507－509.

［4］王晶宇，王志平，赵俊丽，等.LY294002联合姜黄素对人膀胱癌EJ细胞的体外抑制作用［J］.中国临床药理学杂志，2011，27（1）：37－41.

［5］Chen L，Han L，Shi Z，et al.LY294002enhances cytotoxicity of temozolomide in glioma by down－regulation of the PI3K／Akt pathway［J］.Mol Med Report，2012，5（2）：575－579.

［6］Wu D，Tao J，Xu B，et al.Phosphatidylinositol 3－kinase inhibitor LY294002suppresses proliferation and sensitizes doxorubicin chemotherapy in bladder cancer cells［J］.Urol Int，2011，87（1）：105－113.

［7］金正均.合并用药中的相加［J］.中国药理学报，1980，1（2）：70－76.

［8］Schwartzbaum JA，Fisher JL，Aldape KD，et al.Epidemiology and molecular pathology of glioma［J］.Nat Clin Practice，2006，2（9）：494－503.

［9］Brozovic A，Osmak M.Activation of mitogen－activated protein kinases by cisplatin and their role in cisplatin－resistance［J］.Cancer Lett，2007，251（1）：1－16.

［10］Morgensztern D，McLeod HL.PI3K／Akt／mTOR pathway as a target for cancer herapy［J］.Anti Cancer Drugs，2005，16（8）：797－803.

［11］Chong ZZ，Maiese K.Targeting WNT，protein kinase B，and mitochondrial membrane integrity to foster cellular survival in the nervous system［J］.Histol Histopathol，2004，19（2）：495－504.

［12］Fujiwara M，Izuishi K，Sano T，et al.Modulating effect of the PI3－kinase inhibitor LY294002on cisplatin in human pancreatic cancer cells［J］.J Exp Clin Cancer Res，2008，27：76.

［13］Asechi H，Hatano E，Nitta T，et al.Resistance to cisplatin－induced apoptosis via PI3K－dependent survivin expression in a rat hepatoma cell line［J］.Int J Oncol，2010，37（1）：89－96.

Effect of LY294002 combined with CDDP on proliferation in glioma U87 cells in vitro＊

Li Tao1，Wan Zhixian2＃，Luo Ran2，Wang Xiongwei2△，Zeng Hui2，Liu Chaoqi3，Wang Lei2，Wang Wei2，Sun Li3
（1.Departmnet of Neardogy，Pu Ren Hospital Wuhan University of Science and Techndogy，Wuhan，Hubei 430081，China；2.Department of Neurosurgery，The First College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443003 China；3.Institute of Neurology，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China）

ObjectiveTo investigate the effects of LY294002and CDDPiamycin（CDDP）on proliferation of glioma cancer cell line U87.MethodsMTT assay was used to examine the inhibition rate cell growth when cells were treated at various concentrations of LY294002and CDDP alone or combination.Cell cycle and apoptosis rate of U87cells were detected by flow cytometry（FCM）after using drugs.Optic microscope was used to detect the morphological changes of U87cells.ResultsBoth LY294002 and CDDP exhibited a dose dependent inhibitory effect on the proliferation of U87cells.The combination of LY294002and CDDP exerted a synergistic effect on U87cell growth inhibition.LY294002in the concentration of 5μmol／L and CDDP in the concentration of 0.625μg／mL interaction was the most synergistic（Q＝1.21）.Combined treatment group raised U87cells′apoptosis and induced G1phase arrest compare with single drug treatment group（P＜0.01）.ConclusionLY294002could effectively induce U87 sensitivity to CDDP.And this conclusion provides theoretical basis for the conbined clinical use of LY294002and CDDP.

glioma；drug therapy；cisplatin；LY294002；growth inhibiting

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.002

A

1671－8348（2012）35－3692－03

宜昌市科技基金资助项目（A01301－10）。 ＃ 共同第一作者。 △

，Tel：13908600067；E－mail：wangxiongwei11＠yahoo.com。

2012－06－13

2012－09－12）

·论 著·