乳酸链球菌抗菌肽的分离纯化及生物活性检测

盛博文，杨海君，关向杰

（湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128）

乳链菌肽即乳酸链球菌肽，又称乳酸链球菌素，它是乳酸链球菌所分泌的一种具有抗菌活性的多肽[1-2]。乳链菌肽自发现以来，人们对其基因学、理化特征、微生物学和生物活性研究非常广泛。从20世纪50年代发现乳链菌肽至今，已在60 多个国家得到广泛的应用，主要作为牛奶、乳酪、水果罐头和蔬菜罐头等的生物防腐剂[3]。笔者将从酸菜发酵水中分离得到的乳酸链球菌，通过凝胶过滤及反向层析等方法，从该菌发酵液中筛选分离出具有广谱抗菌活性的物质，并对其抗菌效果进行检测，初步探索了其杀菌机理。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌种 乳酸链球菌（从酸菜发酵液中分离获得并保存）；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）（中国兽医微生物菌种保藏管理中心）；大肠杆菌（ATCC25922）（中国农业科学院植物保护研究所）；绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、耶尔森菌、粪肠球菌（黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心）。

1.1.2 培养基 LB 液体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 用5 mol/L NaOH 调pH至7.0，用去离子水定容至1 L；MH 固体培养基：牛肉粉6 g，可溶性淀粉1.5 g，酸水解酪蛋白17.5 g，琼脂17.0 g，将其溶于1 L 去离子水中，pH 值7.3。

1.1.3 仪器与试剂 仪器：低温超速离心机、冻干机、AKTA 蛋白纯化系统（GE 公司）、制备型反相高效液相色谱LC-8A、半制备C18 柱（ACE）、Sephadex G-25 填料（GE 产品）、超纯水机（ROP-100）、紫外可见分光光度计（UV-3200PC）；试剂：乙腈（Merck 公司）、0.01 mol pH 值6.0 磷酸盐缓冲液、TFA（三氟乙酸）（HPLC 级）。

1.2 方 法

1.2.1 粗提物的获得 将乳酸链球菌划线培养，挑取单个菌落，接种在4 mL LB 液体培养基中过夜培养，然后再将其转移至200 mL LB 液体培养基中，培养7～8 h。4℃、12 000 r/min 离心20 min，收集发酵液上清，0.45 μm 滤膜过滤。低温、真空离心浓缩样品至20 mL 左右，放入-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 凝胶过滤层析 用超纯水以流速3 mL/min冲洗2～3 h，再用洗脱液以同样流速平衡3～5 倍柱床体积。在215 nm 和280 nm 检测波长下，记录色谱曲线，直至基线平稳。分别以215 nm 和280 nm作为监测波长，进行分离纯化。将各峰分别收集并浓缩，以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作为试验样品的指示菌，药敏片法检测各峰的抑菌效果，然后将抑菌峰冻干保存备用。

1.2.3 制备型反相高效液相色谱 样品经分子筛G-25 分离纯化后，将具有抑菌效果的物质冻干，然后溶于超纯水中。将半制备型C18 柱同仪器相连接，将流动相A（上样缓冲液，水+0.05% TFA）、B（洗脱缓冲液，乙腈+0.05% TFA）同仪器的泵相通。调试仪器，并用A 液平衡系统，直至吸收值达到平衡。然后设置自动上样2 mL/次，预试验摸索样品的分离条件，选择最佳条件（表1）。根据峰形收集样品，多次上样，合并同时间的样品，测定抑菌活性，最后将活性物质即乳酸链球菌抗菌肽冷冻浓缩。

1.2.4 抗菌谱检测 将金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌（ATCC25922）、绿脓杆菌、耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌培养至对数生长期，然后将菌液稀释至浓度为105cfu/mL，再将筛选的乳链菌肽0.1 mL 加入到各处理菌液中，设置未加乳链菌肽的样品为阴性对照。将上述各处理放置于恒温生化培养箱中，37℃培养18 h，用紫外分光光度计测定各处理在600 nm 处的光吸收值。

表1 制备型反相高效液相色谱程序设定

1.2.5 乳链菌肽处理细菌的透射电镜检查 取对数生长期的金黄色葡萄球菌（ATCC25923），2 000 r/min 离心5 min，弃上清液，无菌超纯水洗涤3 次。用新鲜的LB 液体培养基重悬稀释细菌，再与乳链菌肽37℃恒温下作用2 h，以灭菌后的超纯水为空白对照。低速离心收集菌体，再用灭菌的超纯水柔和洗涤菌体3 次，将处理好的样品进行负染，透射电子显微镜下观察细菌的特征。

2 结果与分析

2.1 乳酸链球菌的分离纯化

乳酸链球菌发酵液粗体物经过凝胶过滤层析（图1），将分离的各峰分别收集，冻干浓缩后制作成药敏片，以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作为指示菌，测定各峰的抑菌活性。结果表明，3 号峰具有抑菌活性。利用高效液相色谱（图2），对3 号峰进一步的分离，同样以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作为指示菌测定各收集峰的抑菌活性，最终得到有抗菌活性的物质，即乳链菌肽。

图1 Sephadex G-25 凝胶过滤层析

2.2 乳链菌肽抗菌谱检测

图2 高效液相色谱分离乳链菌肽

选择金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌（ATCC25922）、绿脓杆菌、耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌等6 种细菌为供试菌株，对乳链菌肽抗菌谱进行了检测。结果表明，乳链菌肽除了对绿脓杆菌没有杀伤作用，对其他5 种细菌均表现出良好的抑菌效果。由此可见，乳链菌肽是一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽。

2.3 乳链菌肽对细菌损伤的透射电镜检查

为了初步探索乳链菌肽的杀菌机理，将金黄色葡萄球菌（ATCC25923）与乳链菌肽孵育后进行透射电镜分析，观察乳链菌肽对细菌形态及细菌表面结构的影响。如图3 所示，处理前金黄色葡萄球菌（ATCC25923）有着完整的细胞膜结构，细胞表面光滑。经过乳链菌肽处理后，金黄色葡萄球菌（ATCC25923）部分细胞膜界限模糊不清，细胞出现破损或肿胀，菌体部分或完全断裂，并伴有细胞质稀释的现象，细胞内容物外泄，细胞质解体，形成空腔。结果表明，乳链菌肽能够使金黄色葡萄球菌（ATCC25923）细胞壁破裂，使其内容物外渗，最终导致菌体死亡。

图3 乳链菌肽对金黄色葡萄球菌损伤的透射电镜检查

3 讨论与结论

乳链菌肽是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质，是一种安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂[4]。乳链菌肽能够抑制大部分革兰氏阳性菌，特别是细菌的芽孢。它还能抑制链球菌属、葡萄球菌属和乳杆菌属的某些菌种，以及大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢。例如乳链菌肽能有效抑制肉毒梭状芽孢杆菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等引起的食品腐败[5-8]。

研究通过凝胶过滤层析及制备型高效液相色谱法，从乳酸链球菌发酵液中分离出具有广谱抗菌活性的物质，并对其抗菌谱和抗菌机理进行了初步研究。结果表明，经过分离纯化得到的较纯活性物质，即乳链菌肽。它具有广谱抗菌活性，其杀菌机理为通过破坏细菌细胞膜来杀伤细菌。

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