饲料中添加蛋氨酸硒对仿刺参幼参存活、生长及免疫指标的影响

王吉桥，王志香，张凯，张玉满，姜玉声,刘春宝，吴岩强

(1.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023;2.辽宁每日农业集团有限公司，辽宁 盘锦 124212；3. 大连棒槌岛海产有限公司,辽宁 大连 116000)

硒是动物体内必需的微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 的辅助因子。缺硒会影响畜禽的繁殖，但过量的硒对畜禽也有毒性[1]。许多研究表明，鲑科鱼类缺硒时会导致肌营养不良、贫血甚至死亡[2]。在饲料中添加0.17～2.02 g/kg亚硒酸钠等无机硒和富硒酵母等有机硒，能显著提高草鱼Ctenopharyngodonidella[3]、石斑鱼Epinephelusmalabaricus[4]、鲫Carassiusauratusgibelio[5]、斑点叉尾鮰Ictaluruspunctatus[6]、尼罗罗非鱼Oreochromisniloticus[7]、中国对虾Fenneropenaeuschinensis[8]、凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei[9]、中华鳖Trionyxsinensis幼鳖[10]和皱纹盘鲍HaliotisdiscushannaiIno[11]等经济水生动物的生长速度、成活率和消化酶活性，增强其免疫力。但是，目前有关在饲料中添加硒对仿刺参Apostichopusjaponicus生长和免疫力的影响尚未见报道，至于仿刺参饲料中添加硒的适宜类型和剂量等尚属空白。

仿刺参的营养和药用价值很高，是中国北方海水养殖的新增长点。随着中国经济的发展和人们保健意识的增强，仿刺参的消费量急剧增加，而养殖面积的锐减更刺激了仿刺参养殖的快速和无序增长，导致病害不断滋生蔓延。滥用抗菌素等化学药物威胁着环境和食品安全。因此，高效、经济、安全且具有免疫增强功能的饲料是仿刺参养殖业可持续发展的物质基础；在饲料中添加适宜类型和剂量的硒是研发增强仿刺参免疫功能饲料的主要途径之一。目前，畜禽和鱼虾饲料中补充的硒制剂主要有两种, 即亚硒酸钠等无机硒和富硒酵母等有机硒，其中Bell等[12]、Lorentzen等[13]、Wang等[6]、魏文志等[14]、郑宗林等[15]的试验证明，动物对有机硒的利用效果好于无机硒，特别是对蛋氨酸硒的利用效果更好。笔者曾研究了饲料中添加不同类型的硒对仿刺参幼参生长和免疫指标的影响，证明蛋氨酸硒的促生长和增强免疫力的效果最好[16]，但没有详细研究与其剂量的相关性。本试验中，作者在饲料中添加不同梯度的蛋氨酸硒，研究了硒的剂量对仿刺参生长及免疫能力的影响，旨在丰富仿刺参的营养学内容，为科学配制仿刺参饲料，提高仿刺参养殖的经济和生态效益提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用仿刺参初始体质量为1.30～1.68 g，取自辽宁每日农业集团有限公司水产苗种繁育基地。蛋氨酸硒购自浙江韦丰饲料添加剂有限公司，硒含量标准为1 500 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的配制 基础饲料配方(均为质量分数，%)：大豆蛋白7.0，鱼粉11.0，红薯粉和土豆粉等30.0，海泥40.0，虾糠5.0，贝壳粉3.9，酵母1.0，矿物盐 0.8，赖氨酸 0.36，蛋氨酸 0.37，苏氨酸 0.37，黄原胶 0.2。基础饲料中粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的质量分数分别为18.60%、1.69%和55.63%。

其中红薯粉和土豆粉等混合淀粉，在高压锅(120 ℃)内糊化15 min，然后烘干、研磨、粉碎。饲料中所有原料均经100目筛绢过滤，除去上层，混合均匀，制成粉状混合物。投喂前用80 ℃左右的热水搅拌均匀，室温下待酵母发挥作用后即成为松软合适的膏状饲料。由于饲料中添加了质量分数为0.2%的黄原胶增稠剂，因此饲料不易分散。

在基础饲料中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的蛋氨酸硒，以不添加蛋氨酸硒的饲料作为对照组。海水中的硒含量为0.03～6.00 μg/L，饲料原料中的硒含量为0.43 mg/kg。

1.2.2 试验设计和饲养管理 将仿刺参在实验室水槽中驯养20 d后，选择体质量相近的健康个体分成6组，放入容积为40 L的塑料水箱中，每箱放15头仿刺参幼参，投喂硒添加量为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的6种饲料，分别记为对照组、A、B、C、D、E组，每组设3个重复。

试验水箱内24 h充气。水温为14.0～8.0 ℃，盐度为30.0～32.0，pH为7.5左右。试验期间采用自然光照，隔天换水100%。在换水的当天17:00投喂，开始时投喂量为仿刺参体质量的2.0%，随着仿刺参的生长和摄食量的增加投喂量增大，稍过量投喂。投喂时将糊状饲料均匀涂在波纹板上，放在水槽底部，将充气石压在板下，涂抹饲料面朝上。仿刺参摄食后排出的粪便呈规则的长条状，不分散，有利于残饵和粪便的辨别和收集。

试验共进行60 d，分3个周期，每个周期20 d。

1.2.3 项目的测定与方法 试验结束时，每组随机取20头仿刺参，抽取体腔液，在-20 ℃下保存，用于体腔液中酶活力的测定。取各组仿刺参的肠，去除肠内粪便，采用冷冻干燥法对肠和体壁进行干燥后用于测定硒的含量，余下的仿刺参体壁风干后用于粗蛋白、粗灰分和粗脂肪等成分的测定。

市政府于2010年年底出台《关于加快推进郊区集约化供水的实施意见》，将郊区集约化供水列入市政府实事项目和重大工程重点推进。截至2013年11月底，上海市陆域部分的集约化供水工作已完成，共关闭郊区中小型水厂150座,取消内河取水口94个，注销深井取水许可证161个，达到了集中保护水源、优化水厂布局、压缩地下水开采量、提高供水水质和管理服务水平、改善郊区发展环境等预期效应，受到广大郊区市民的欢迎。

采用氢化物发生-原子吸收光谱法，用通用的TAS-990AFG型原子吸收分光光度计测定仿刺参体壁中硒的含量。样品经冷冻干燥后，用10～15 mL浓硝酸-高氯酸消解，在波长为196 nm，载气流量为150～180 mL/min条件下测定。

使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，并按其方法测定仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和酸性磷酸酶(ACP)的活性。

每饲养20 d测定各水槽中仿刺参的总质量，计算其特定生长率(SGR):

SGR=[(lnWf-lnW0)/t]×100%,

其中:Wf为终末体质量(g);W0为初始体质量(g);t为饲养时间(d)。

在每个饲养周期结束前5 d，投喂添加质量分数为0.5%的三氧化二铬(Cr2O3)饲料，收集无破损的粪便，烘干，用来测定仿刺参对饲料的消化率。

总表观消化率= (1- 饲料中Cr2O3含量/粪便中Cr2O3含量) ×100%。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 饲料中蛋氨酸硒的添加量对仿刺参特定生长率及体成分的影响

经过60 d的饲养，各组仿刺参的成活率均为100%，说明饲料中添加蛋氨酸硒对成活率没有显著影响，但对仿刺参的生长有显著影响。从表1可见：当硒添加量为0.2～0.6 mg/kg时，仿刺参的特定生长率随添加量的增加而增大，C组显著高于对照组、A组(P<0.05)；之后，随着蛋氨酸硒添加量的增加，特定生长率反而下降，特别是当添加量为1.0 mg/kg(E组)时，仿刺参的特定生长率最低，除与A组差异不显著外(P>0.05)，显著低于其余各组(P<0.05)。这说明饲料中硒的添加量有一个界限，呈现“低—高—低”的抛物线形状，当添加量为0.6 mg/kg时，仿刺参的生长效果最好；超过这个剂量时，反而对生长有副作用。

表1 饲料中蛋氨酸硒添加量对仿刺参特定生长率的影响

注：同列中标有不同字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同字母者表示组间差异不显著(P>0.05)，下同。

Note: Means in the same column followed by different letters denote significant differences at 0.05, and the means in the same column followed by the same letters represent insignificant differences at 0.05，et sequentia.

从表2可见：各试验组仿刺参体壁干物质中蛋白质含量均显著高于对照组(P<0.05)，其中B组最高；各组仿刺参体壁干物质中粗脂肪的含量差异均不显著(P>0.05)；B组仿刺参体壁干物质的粗灰分含量最低，显著低于对照组(P< 0.05)，而其它各组与对照组差异均不显著(P>0.05)。

2.2 饲料中蛋氨酸硒的添加量对仿刺参表观消化率的影响

从表3可见：各试验组仿刺参对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率的变化规律基本相同，均在添加量为0.6 mg/kg时最高，与对照组差异显著(P< 0.05)。这表明在饲料中添加0.6 mg/kg蛋氨酸硒能促进仿刺参对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率，超过这个添加量，仿刺参对干物质和粗蛋白的消化率反而显著低于对照组(P< 0.05)，这与蛋氨酸硒的添加量对仿刺参特定生长率的影响一致。仿刺参摄食添加不同剂量蛋氨酸硒饲料时，对饲料粗脂肪的表观消化率没有显著差异(P>0.05)。

表2饲料中蛋氨酸硒的添加量对仿刺参体壁干物质中各成分的影响

Tab.2 Approximate composition (in dry matter) of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of selenomethioninew/%

表3 仿刺参摄食添加不同量的蛋氨酸硒饲料时的表观消化率

2.3 饲料中蛋氨酸硒的添加量对仿刺参肠道和体壁中硒含量的影响

各试验组仿刺参体壁和肠道中的硒含量呈现“低—高—低”的变化趋势(图1)，即随饲料中蛋氨酸硒添加量的增加，仿刺参体壁和肠道中的硒含量逐渐增加。其中B组仿刺参体壁中的硒含量最高，C组仿刺参次之，均显著高于其它组(P<0.05)；而E组的含量最低，显著低于其余各组(P<0.05)；A组和D组仿刺参体壁中的硒含量与对照组差异均不显著(P> 0.05)。

仿刺参肠道中硒含量的变化趋势基本与体壁中的硒含量相似(图1)，但有所不同的是，C组仿刺参肠道中硒的含量最高，显著高于A、B、E组和对照组(P<0.05)；当饲料中硒的添加量高于0.6 mg/kg时，仿刺参肠道中硒的含量反而降低，即肠道中硒含量的变化比体壁中硒的变化更敏感。

图1 摄食添加不同剂量蛋氨酸硒饲料的仿刺参体壁和肠道干物质中的硒含量Fig.1 The selenium levels in dry matter in the body wall,and intestine of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of selenomethionine

2.4 饲料中蛋氨酸硒的添加量对仿刺参体腔液中酶活力的影响

从表4可见：仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)的活力随饲料中蛋氨酸硒添加量的增加而升高，当添加量达0.8 mg/kg时，SOD活力最高，除E组外,其余各试验组均显著高于对照组(P<0.05)；当添加量为1.0 mg/kg时，SOD活力最低，显著低于其余各组(P<0.05)。当蛋氨酸硒添加量≤0.8 mg/kg时，仿刺参体腔液中过氧化氢酶(CAT)的活力均显著高于对照组(P< 0.05)；而蛋氨酸硒添加量为1.0 mg/kg时，CAT活力最低，显著低于其余各组(P< 0.05)。各试验组仿刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)的活性均显著高于对照组(P<0.05)。

表4 摄食添加不同剂量蛋氨酸硒饲料的仿刺参幼参体腔液中几种酶的活力

3 讨论

3.1 仿刺参对饲料中硒的需要量

动物体内的硒主要来自摄取的食物，对有机硒的利用率大于无机硒。Bell等[12]给大西洋鲑Salmosalar投喂鱼粉、亚硒酸钠、半胱氨酸硒和蛋氨酸硒等不同形式的硒，结果发现:饲料中加硒组的鱼的增重率大于缺硒组的鱼,鲑对蛋氨酸硒的消化率最高 (92%)，对鱼粉的消化率最低(47%)。异育银鲫饲料中添加有机硒(多糖硒和蛋白硒0.2 mg/kg饲料),鱼的增重率比对照组和无机硒组分别高15.29%和14.59%，而饲料系数降低12.49%和 12.35%[14]。本试验中，在仿刺参饲料中添加蛋氨酸硒，取得了较好的效果。经测定，本试验的基础饲料中硒的含量为0.2355 mg/kg，这比常用鱼类饲料中的含量高。

动物对硒的营养需要存在适宜剂量范围,即硒的剂量-效应关系曲线[17-19]。超过这个范围,会引起硒缺乏症或急、慢性中毒。本试验结果表明：随着饲料中硒添加量的增加，仿刺参的特定生长率和体壁中蛋白质的含量都提高，当硒添加量为0.6 mg/kg时，达到最高值，然后再提高添加量，特定生长率和体壁中蛋白质的含量均下降。这表明本试验基础饲料中蛋氨酸硒的最适添加量为0.6 mg/kg，当添加量达到1.0 mg/kg时，仿刺参的生长效果低于对照组，说明硒的含量过高会抑制仿刺参的生长。Lin等[4]的研究表明，饲料中硒的添加量为0.77 mg/kg时，石斑鱼Epinephelusmalabaricus幼鱼的增重率和饲料效率最高；硒添加量为4.00 mg/kg时,其增重率和饲料效率最低。这与本试验结果接近，符合Weinberg 原理。苏传福等[3]发现，草鱼摄食硒添加量为0.6 mg/kg的饲料时，其生长、营养组成和消化酶活性与本试验结果一致。本试验中，仿刺参幼参摄食硒添加量为0.6 mg/kg的饲料时与未添加硒组(对照组)生长效果显著不同，说明基础饲料中原有的硒含量不能满足仿刺参的生长需求，必须在饲料中添加硒。

本试验中，当饲料中添加0.6 mg/kg蛋氨酸硒时，仿刺参体壁中干物质的含量最高，显著高于对照组。这可能是饲料中的蛋氨酸硒替代蛋氨酸进入仿刺参体内，促进了仿刺参的生长。通常，硒以两种形式存在于蛋白质中：一种是可离解的因子，另一种是以共价键与氨基酸结合的形式存在。第一种形式的硒多见于细菌，而哺乳动物中的硒以共价键的形式存在于蛋白质中[18]，其中主要涉及到两个氨基酸，即硒半胱氨酸(Se—Cys)和硒蛋氨酸(Se—Met)，后者在蛋白质中可代替蛋氨酸的存在，而Se—Cys只在蛋白质的特定位点发挥特殊的功能，主要催化氧化—还原反应[13]。

3.2 硒添加量对仿刺参体壁和肠道中硒含量的影响

本试验中，仿刺参的体壁和肠道干物质中硒的含量都随饲料中硒含量的增加而增加，当硒含量分别为0.4 mg/kg和0.6 mg/kg时达到最高点，然后再随着饲料硒含量的增加而下降。沈梅等[20]研究表明，饲料中硒含量的差异对动物体内硒含量影响较大，饲料中添加硒可以直接提高动物体中硒的含量。Wang等[6]发现，饲料中蛋氨酸硒含量与斑点叉尾鮰肌肉中硒含量的相关性最好，酵母硒次之。以上学者的试验结果都与本试验的结果相吻合。另外，仿刺参肠道中硒的含量高于体壁中硒的含量，说明体壁中的硒是仿刺参的消化道吸收了饲料中的硒，并经过新陈代谢最终到达体壁中。生成的途径不同，从而导致二者硒的含量有一些差异。

3.3 硒对仿刺参体液免疫的影响

CAT和SOD都是生物体清除活性氧、免受细胞氧化伤害的主要抗氧化酶类，在防御机体衰老和生物分子损伤等方面有着极为重要的作用。硒作为一种抗氧化剂并不是直接发挥作用,而是作为依赖硒的谷胱甘肽过氧化物酶的核心组成部分,参与有机和无机过氧化物的清除过程[21-23]。当生物体受到轻度逆境胁迫时, 通常SOD活性升高，表现为一种抗应激反应， 而当受到重度逆境胁迫时，SOD 活性通常降低，使机体积累过量的活性氧，导致生物体的伤害[24]。饲料中添加硒对皱纹盘鲍血清中CAT、SOD都有显著影响[11]，当硒添加量为0.6 mg/kg时，能使皱纹盘鲍血清中的抗氧化物酶系统总体达到相对平衡,有效地抵抗氧化损害。

本试验中，仿刺参摄食不同添加量的蛋氨酸硒饲料时，体腔液中的SOD活力显著不同，呈现先升高后下降的趋势，当硒添加量为0.8 mg/kg时最高，其次是在0.6 mg/kg时。王宏伟等[25]发现，中华米虾Caridinadenticulatasinensis体内SOD 的活性随着饲料中硒添加量的增加先上升后下降，这与本试验结果相似。硒元素作为仿刺参生长不可缺少的营养元素，在饲料中适量添加可以提高仿刺参体内SOD的活力，增强其免疫力。

本试验结果表明，添加硒的各组仿刺参体腔液中CAT的活力(除1.0 mg/kg组外)均显著高于对照组，其中添加量为0.4 mg/kg时最高，其次是0.6 mg/kg时。这说明硒含量的增加对提高仿刺参CAT的活力有一定的协同作用，但高剂量的硒却会抑制CAT的活力。

ACP能参与水生动物的磷酸酯代谢，具有调节新陈代谢、促进能量转化和信号传导等作用。本试验中，各试验组仿刺参体腔液中的ACP酶活力明显不同，但均显著高于对照组，其中添加量为0.4 mg/kg时ACP酶活力达到最高，其次是0.6 mg/kg时，表明饲料中添加适当剂量的蛋氨酸硒能促进仿刺参对生物磷的代谢能力，进而促进仿刺参的生长。这与蛋氨酸硒能促进仿刺参特定生长率的结果呈正相关。

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