8味中药对奶牛乳房炎病原菌的体外抑菌试验

郭 庆，朱 伟，易 琼，何炳坤，徐宾朋，王 鲁

（1．贵州大学贵州省生化工程中心，贵州 贵阳550025；2．安徽科宝生物工程有限公司，安徽 淮北235025；3．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025；4．北京生泰尔生物科技有限公司，北京 昌平102206）

奶牛乳房炎是由各种病因引起的乳房炎症，该病从发现至今已经有150多年的历史，给奶牛业造成巨大的经济损失。致病因素中细菌感染的乳房炎占大多数，主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌等［1－3］。本省奶牛乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌和链球菌，所占比例为81．79%［4］。目前，虽已有许多措施用于此病的防治，大多用抗生素、激素和化学合成药等防治奶牛乳房炎，由于长期使用耐药菌株增加，内分泌功能紊乱，抗生素残留和兽药残留超标等问题，给畜产品及公共卫生带来危害［5－6］。中草药是纯天然物质，具有抗菌、消炎、低毒和细菌不易产生耐药性等特点，应用中草药替代抗生素防治奶牛乳腺炎，已日益为国内外学者所认识。本试验采用试管二倍稀释法，比较8味中药对3种主要致病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，旨在筛选出效果最好的中药，为研制治疗奶牛乳房炎方剂提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 中药 金银花、蒲公英、连翘、芙蓉花、瓜蒌、大黄、黄芪、当归均为生药，购于贵阳市云岩区头桥中药店，经贵州大学中药实验室鉴定。

1．2 试验菌株 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌，均由贵州大学预防兽医学实验室自贵阳某奶牛场患有隐性乳房炎牛奶中分离、鉴定提供。

1．3 仪器 HH－4数显恒温水浴锅；DL－360B智能超声波；微量移液器；LD4－2低速离心机；LDZX－50KB立式电热压力蒸汽灭菌器；RE－52旋转蒸发仪；HH－B11－500型电热恒温培养箱；SW－CJ－1F单人双面净化工作台。

1．4 试剂及培养基 牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨，购自贵州赛兰博生物科技有限公司；石油醚、酒精等均为分析纯；普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、LB培养基，参照文献［7］制备。

1．5 中药液制备 将金银花、蒲公英、连翘等分别准确称取100g，用70%乙醇浸泡30min（料液比10∶1），然后超声15min，回流提取第1次2h，用16层纱布过滤倒出药液。药渣再加70%乙醇（料液比8∶1），第2次1h，倒出药液，合并2次滤液，旋转蒸发至无醇味，加入石油醚萃取，水相浓缩至1 g／mL，3 000r／min离心10min，取上清液，121℃流通蒸汽灭菌15min。灭菌后4℃保存备用。

1．6 试验菌株的准备 将试验菌株复壮、活化后接种普通肉汤培养基和LB培养基中，置于恒温培养箱37℃培养18～24h，比浊管比浊至0．5个麦氏比浊管（1%BaCl20．5mL，1%H2SO499．5mL），即将菌液配成1．5×108CFU／mL，备用。

1．7 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度的测定（MBC）试验 采用试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）：操作全部在超净工作台内进行。（1）取加塞无菌小试管9支，每管中加入制好的普通肉汤培养基1mL，在第1管加中药1mL，用微量移液器混匀，吸取1mL至第2管混匀，依次到第7管，第8管做阳性对照（加菌液不加中药），第9管做阴性对照（加中药不加菌液）。（2）加稀释好的菌液0．1 mL，第9管不加菌液。此时1号到7号管内药液的浓度分别相当于500mg／mL、250mg／mL、125mg／m、62．5mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL、7．81mg／mL生药浓度，8号管作阳性对照管，9号管作阴性对照管。（3）将各组试管置37℃恒温培养箱中培养18h，观察记录结果。与对照组比较，有絮状沉淀的管则为有细菌生长，无絮状沉淀的管为细菌生长受抑制管，以肉眼观察无絮状沉淀管的最低药物浓度作为该药的最低抑菌浓度（MIC）。（4）重复1至3步，试验结果取3次的平均值。（5）结果的判断标准：由于中草药对细菌的MIC国内目前尚无统一的标准，本试验参照同类试验［8］的标准作为判断标准。即当MIC＜7．81mg／mL生药浓度时为高度敏感；当 MIC在15．63～62．5mg／mL生药浓度时为中度敏感；当 MIC为62．5～250．00mg／mL生药浓度时为较敏感；当MIC＞250．00mg／mL生药浓度时为不敏感。测出最低抑菌浓度（MIC）后，再依次从未见细菌生长的各试管培养物中取一接种环，接种于不含药的普通琼脂平板上，轻轻摊开菌液，37℃培养24h，观察有无细菌生长。普通琼脂平板中，生长的菌落数小于5个菌落的药液最低浓度，即为最低杀菌浓度（MBC）。

2 结果

8味中药对3种致病菌的体外最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定结果见表1。

表1 中药对3种致病菌的MIC和MBC （mg／mL）

从表1中可以看出，金黄色葡萄球菌对金银花、蒲公英、连翘、大黄中度敏感；芙蓉花、黄芪次之；大肠杆菌对芙蓉花中度敏感；金银花、蒲公英次之；无乳链球菌对芙蓉花中度敏感；除黄芪不敏感其余为较敏感。

3 讨论

3．1 本试验所用菌株直接从患病奶牛乳中分离并鉴定，用中草药提取物对3种细菌的抗菌活性进行测定，其结果更有说服力。从本次试验结果可知，中草药对这3种细菌的抗菌活性与文献报道［9－11］相一致。中药的产地，不同细菌分离菌株和毒力是影响中药体外抑菌试验结果的重要因素。

3．2 本试验采用乙醇回流提取法提取药液来测定其抑菌效果，效果最好的芙蓉花对3种致病菌体外最低抑菌浓度分别为 62．50mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL。金银花、连翘对金黄色葡萄球菌体外抑菌效果最好，浓度均为15．63mg／mL。从本次试验结果可知，芙蓉花、金银花、连翘可作为防治奶牛乳腺炎制剂的主药，但与其他药物之间的配伍作用及其体外药理作用还需要进一步研究。

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