新型饲料添加剂玉米小肽的制备及肠吸收的初步研究

张晓峰 李凤玲 边传周

(郑州牧业工程高等专科学校，河南郑州450011)

肽是由一定数量的氨基酸通过肽键相连而成的有机物，一般把肽键中氨基酸数为2～20个的肽称为寡肽或小肽，而将肽链长度大于20个氨基酸的肽称为多肽。近代研究表明，蛋白质吸收的主要形式不是以氨基酸的形式而是以小肽的形式完整吸收，小肽转运系统具有速度快、耗能低和不易饱和等特点，以肽的形式吸收的氨基酸强度要比以游离氨基酸混合物吸收的强度高出70%～80%，其可以直接通过小肠壁进入血液，进而影响动物体内蛋白质代谢[1]。肽作为动物消化道蛋白质的主要酶解产物,是迅速吸收的氨基酸供体，同时释放的许多肽具有活性作用，能够调节机体的生命活动[2]，而且，酶水解蛋白还可以释放生物活性肽[3]，生物活性肽具有众多有利于动物生长的功能和特点，一些生物活性肽可通过诱导小肠中一些酶活性的提高，促进机体的健康、提高机体免疫力及其生产性能[4]。研究表明，在饲料中添加一定量的生物活性肽能够调节动物体消化系统，提高动物的生产性能，增强动物免疫力，小肽在动物蛋白质营养中的作用越来越受到关注[5]，玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的副产物玉米面筋粉（Corn Gluten Meal缩写CGM，俗称玉米渣），大约含60%的蛋白质，主要是由玉米醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）和球蛋白（1.2%）组成。然而玉米蛋白水溶性差，组成复杂，口感粗糙，严重影响了其在动物肠道系统内的吸收利用，采用生物酶制剂通过较容易的控制条件实现对玉米蛋白粉的有限水解，制备高可吸收的小肽产品对于提高玉米蛋白质的利用率、显著增加其营养价值和保健功能、节约有限的蛋白质饲料资源、减少氮的污染具有重要意义。本文采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对玉米蛋白进行二次酶解，获得口味较好、得率较高的小肽产品，并对其氨基酸组成和肠吸收进行了初步研究，以期为酶解玉米蛋白制备小肽作为维护动物肠道健康的饲料添加剂及玉米小肽的进一步复配奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米蛋白粉(河南新麦兹淀粉厂生产，蛋白含量61.8%)，碱性蛋白酶(诺维信酶制剂公司生产，酶活力100 000 U/ml)，风味蛋白酶(诺维信酶制剂公司生产，酶活力 50 000 U/g)，NaOH、HCl；酸度计、水浴槽、超滤装置、喷雾干燥器，结晶牛血清白蛋白(中国医药公司北京采购供应站)；Folin-酚试剂；台氏保养液(Tyrodes)；纯氧；豚鼠：体重300～650 g，752型紫外可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 玉米小肽的制备

1.2.2 三氯乙酸氮溶指数（TCA-NSI）测定

微量凯氏定氮法：取玉米蛋白水解液10 ml，加入10 ml 10%的三氯乙酸（TCA），混合后放置 30 min，于4 000 r/min离心10 min，取离心后的上清液5 ml进行微量凯氏定氮，可测得三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)。

1.2.3 玉米小肽肠吸收的初步研究

1.2.3.1 台氏保养液的配置[6]

NaCl 8 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、NaH2PO40.05 g、MgCl0.1g、NaHCO31g、葡萄糖 1g，最后定容到 1000ml。CaCl2单独溶解并充分稀释后再与其它成分配成的溶液相混合，否则可能导致碳酸钙或磷酸钙沉淀析出，葡萄糖应在临用时加入。

1.2.3.2 玉米小肽的肠吸收测定

豚鼠离体肠囊实验法[7-8]。豚鼠一只，禁食（不禁水）24 h，然后拉颈处死，立即剖开腹部，轻轻剪取回肠一段，去除系膜，放于台氏液瓶中洗净，剪取约5 cm结扎一端，将其翻转使黏膜面朝外，放入保养液中清洗，取出用滤纸吸干液体，用移液器向肠内注入保养液适量以恰好使黏膜表面的绒毛变直为度，扎住。然后将其放入盛有台氏保养液的三角瓶中，充入纯氧，在37℃恒温水浴槽上缓慢摇动温浴，温浴前在黏膜侧保养液中加入一定量的玉米多肽溶液(1 mg/ml)，温浴1 h。采用Folin-酚法测定温浴前后回肠内玉米小肽的浓度，同时做一空白试验以校正肠囊本身的影响。

玉米小肽溶液(1 mg/ml)和吸收促进剂脱氧胆酸钠溶液(2 mg/ml)按10：1混合,按照以上方法测定吸收促进剂脱氧胆酸钠对玉米小肽肠吸收的影响。

每小时玉米多肽吸收量=温浴前玉米小肽浓度-温浴后玉米小肽浓度。

1.2.3.3 玉米小肽含量的测定

采用 Folin-酚试剂法(余冰宾，2004)[9]。

1.2.3.4 标准曲线的绘制

精确称取结晶牛血清白蛋白，溶于蒸馏水，配制成 250 μg/ml的标准溶液，分别精密吸取此液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于试管中，用水补足到 1 ml，依次加入Folin-酚试剂A液5 ml，室温放置10 min，依次加入Folin-酚试剂B液，立即摇匀，室温下放置30 min，取出冷却至室温，在700 nm处分别测定各管中溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 玉米小肽的制备结果

pH=9时玉米蛋白粉未经任何处理的氮溶指数仅为6.65%，而经过二次酶解后所得的玉米小肽的三氯乙酸氮溶指数可高达94.1%，玉米小肽得率在73%以上。这是因为随着酶解的进行，玉米蛋白中可解离的基团(NH+4，COO-)数目增多，小分子量的小肽分子数目增多，这些新暴露的离子化氨基和羧基提高了水解产物的亲水性，大幅度提高了玉米小肽的溶解性。三氯乙酸能够沉淀所有的蛋白质和长肽，可定性反映蛋白的分解情况，玉米小肽的三氯乙酸氮溶指数高达94.1%，说明玉米小肽中小肽的含量很高，而且酸稳定性很好。

2.2 玉米小肽氨基酸组成(见表1)

表1 玉米小肽氨基酸组成

研究表明，各种必需氨基酸除了要求数量足够，还要求互相间的比例恰当才能为机体充分利用，由表1可以看出，玉米蛋白经二次酶解后其氨基酸组成中缺乏Lys、Thr、Trp三种机体必须氨基酸，这大大限制了玉米小肽在动物体内的充分利用。

2.3 玉米小肽肠吸收的初步研究

2.3.1 标准曲线的绘制

以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线如下：

标准蛋白对吸光度的线性回归方程：y=0.002x+0.039 6，R2=0.991 6。由图1可以看到，各点在直线两侧分布均匀，线性回归良好。

2.3.2 玉米小肽肠吸收量的测定

精密吸取肠囊温育前后的黏膜侧液0.1 ml，用水补足到1 ml，Folin-酚法测定温育前后玉米多肽的浓度，计算1 h肠的小肽吸收量，结果见表2。

表2结果表明，玉米小肽1 h内在5 cm回肠内的平均吸收量为47.25 μg/ml，平均吸收率为26.45%，大大高于相同条件下胸腺多肽的平均吸收率17.34%，略低于脑多肽的吸收率31%[10]。

3 结论

玉米蛋白粉经碱性蛋白酶和风味蛋白酶二次酶解后，其酶解液的三氯乙酸氮溶指数（TCA-NSI）高达94.1%，玉米小肽得率在73%以上，并且经豚鼠离体肠囊实验法测定玉米小肽的肠吸收结果表明：玉米小肽1 h内在5 cm回肠内的平均吸收量为47.25 μg/ml，平均吸收率为26.45%，大大高于相同条件下胸腺多肽的平均吸收率17.34%，略低于脑多肽的吸收率31%。

表2 玉米小肽1 h内在5 cm回肠内的吸收量及吸收率

小肠内消化是整个消化过程中最重要的阶段，饲料通过小肠后，消化过程基本完成，许多营养物质也在小肠被吸收,由于离体肠囊实验法将肠道内的各种酶清洗掉了,因此不存在对小肽的降解作用，完全是小肠对玉米小肽的自然吸收，而且由表1可知，玉米小肽中缺乏3种必需氨基酸，这限制了玉米小肽的充分利用，由此可以推断,如果在正常的体内肠道生理条件下，在各种酶的作用下，如果补充以缺少的必需氨基酸，玉米小肽的吸收率会更高。正是玉米小肽在小肠内高的自然吸收率，小肽对于促进动物肠道系统的早期快速发育、增强消化系统发育尚未成熟、消化酶活性低及患有胃肠疾病动物的营养吸收、维护肠道健康、补充动物在快速生长期和高产期对氨基酸的需求具有重要意义，因此，酶解玉米蛋白制备玉米小肽作为饲料添加剂，对于调控动物的营养生理代谢机制，维护动物肠道健康，进一步提高动物生产性能和健康水平，具有广阔前景。

[1]杜保华.寡肽在动物营养消化吸收中的作用[J].饲料研究,2011(1):24-26.

[2]施用晖,乐国伟.生物活性小肽在动物生产中的应用前景[J].饲料工业,2001,22(7):34-36.

[3]陈新,陈庆森,庞广昌.酶解玉米蛋白生产生物活性多肽的研究现状及开发趋势[J].食品科学,2004,25(7):202-205.

[4]计成.新型蛋白质饲料开发与利用[M].化学工业出版社,2006(1):92-98.

[5]陈路,张日俊.生物活性肽（或寡肽）饲料添加剂的研究与应用[J].动物营养学报,2004,16(2):12-15.

[6]张忠泉,包翠屏.药理学实验指导[M].河南医科大学出版社,2000(11):7-8.

[7]徐叔云.药理学实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1982:878.

[8]何盛江,栾立标.翻转肠囊法法研究吸收促进剂对小肠吸收苦参碱的作用[J].药学进展,2004,28(3):126-128.

[9]余冰宾.生物化学实验指导[M].清华大学出版社,2004(1):133-136.

[10]熊玉卿,付颖君,周秦秦,等.脑多肽肠吸收的实验研究[J].中国药理学通报,1996,1(6):573.