枯草杆菌肠球菌二联活菌胶囊对非酒精性脂肪性肝炎患者血清内毒素水平的影响

杨林辉 郭昭友 曹 明 向 姝 刘国栋 谭朝霞

近年来，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发病率正稳步上升。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD病程进展中的主要阶段，可以进一步发展为肝纤维化、肝硬化[1]，甚至原发性肝癌[2]。NAFLD的发病机制至今尚未明确。在众多致病因素中，小肠细菌过度生长、细菌移位、肠黏膜通透性改变等所致的肠源性内毒素血症 （intestinal endotoxemia，IETM）在NASH发病中起着重要的作用[3，4]。随着“肠-肝”轴（Gut-Liver Axis）[5]这一概念的提出，肠道微生态失衡及肠粘膜屏障的损害正成为肝病研究的热点。目前，对于NASH患者肠道通透性的研究鲜见报道。本文就NASH患者肠道通透性的变化及其与IETM的关系进行了初步研究，并采用微生态制剂枯草杆菌肠球菌二联活菌胶囊进行干预治疗，以观察其对NASH患者肠道通透性及血清内毒素水平的影响。

资料与方法

一、研究对象及分组 2010年3月至2011年10月本院经临床、实验室和B超检查诊断为NASH患者60例，男性32例，女性28例，年龄25～70岁，平均年龄47.5±l2.3岁。所有患者诊断符合NASH诊断标准[6]。排除肝炎病毒感染，排除应用抗生素、微生态调节剂、酸奶、胃肠道动力药物及其他可影响肠道通透性制剂的患者。另选择30例健康成年人为对照组，男女各15例，年龄20～70岁，平均年龄47.1±10.7岁。

二、给药方法 健康人不给药物处理；治疗组给予枯草杆菌肠球菌二联活菌胶囊（美常安，北京韩美药品有限公司）500 mg口服，3次/日，治疗4周。

三、血清学指标检测 采用酶学分光光度法检测D-乳酸（D-乳酸、D-乳酸标准液和D-乳酸脱氢酶为美国Sigma公司产品）；采用分光光度法测定二胺氧化酶（DAO，邻茴香胺甲醇溶液、尸胺二氢氯化物、辣根过氧化物酶和二胺氧化酶标准液为美国Sigma公司产品）；采用鲎试剂基质偶氮显色法测定血清内毒素（试剂盒由上海伊华医学科技公司提供）；使用酶法检测血清ALT（日本日立公司生化分析仪）。

结果

一、两组人群有关指标的比较 NASH患者血清内毒素与健康组比较显著增高，且具有统计学意义（t=7.71，P＜0.01）；美常安治疗后与治疗前比较，血清内毒素水平显著下降，且具有统计学意义（t=-3.72，P＜0.01，表1）。

表1 两组血清内毒素、DAO、D-乳酸和ALT水平（）的比较

表1 两组血清内毒素、DAO、D-乳酸和ALT水平（）的比较

与健康组比较，①P＜0.01，②P＜0.05；与治疗前比较，③P＜0.01，④P＜0.05

组别 例数 时间 内毒素（EU/l）DAO（U/ml）D-乳酸（mg/l）ALT（U/l）正常人 30 109.8±17.81 2.3±0.48 5.3±0.97 27.7±6.89 NASH 60 治疗前 143.6±21.41① 2.6±0.47② 6.1±1.05① 84.9±23.84治疗后 127.6±17.90③ 2.4±0.45④ 5.6±1.03③ 68.4±17.84③

二、两组肠道通透性的变化 NASH患者血清二胺氧化酶及D-乳酸与健康组比较显著增高（t=2.24，P＜0.05；t=4.89，P＜0.01）；美常安治疗后与治疗前比较，血清二胺氧化酶及D-乳酸水平显著下降（t=-2.26，P＜0.05；t=-4.50，P＜0.01，表1）；由于血清二胺氧化酶及D-乳酸水平能较好地反映肠道通透性的变化[8]，故结果提示NASH患者较健康人群肠道通透性显著增高，而当应用美常安治疗后，NASH患者肠道通透性明显下降。

三、两组血清ALT水平的变化 美常安治疗后与治疗前比较，NASH患者血清ALT水平显著下降（t=-4.55，P＜0.01，表1）。

讨论

人类正常肠道菌群由30属500种细菌组成,形成一个极其复杂的微生态系统，各菌群间按一定比例组合，互相制约、互相依存，在质和量上形成一定的生态平衡。这些正常菌群对人体消化吸收起着重要作用。肝脏与胃肠道的解剖和功能关系密切，两者相互依存，相互影响，被学者称为肠-肝轴[4]。肠粘膜屏障能够防止肠内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环。肠粘膜通透性与肠屏障功能有关。肠腔内渗透压改变、疾病、药物、饮食、细胞因子、激素等均可引起肠粘膜通透性的改变而影响肠屏障功能[7]。有证据表明NASH存在肠道菌群失调、革兰阴性杆菌过度生长和IETM[3，4]。

由于肠粘膜通透性改变能准确反映肠粘膜损害，通过检测血D-乳酸和DAO活性，可间接反映肠道黏膜的完整性和通透性变化[8]。本研究显示治疗前NASH患者与正常对照组比较，DAO、D-乳酸和内毒素水平显著增高，提示NASH患者肠道通透性增高并存在IETM。由于肝肠关系密切，在正常情况下，肠粘膜是抵御外源性物质入血的第一道屏障，肝脏则提供第二道屏障防护。当脂肪肝患者进展到NASH时，肝细胞发生凋亡、坏死，肝功能进一步受损。肝功能受损后，肝细胞排泌胆汁减少[9]，改变了肠道微生态环境；肝脏处理肠道来源毒物的能力降低，而且肠道毒物可能蓄积损害肠粘膜屏障；NASH患者肠道消化功能下降，肠蠕动减慢、延迟，使肠道清除能力降低，给过路菌提供接触、粘附黏膜的机会；肠道运动减弱，分泌、吸收减少，对细菌的机械排空作用减弱；抗体、溶菌酶、粘液及酸碱分泌减少，使环境有利于细菌生长，肠壁局部抵抗力下降，肠腔内pH上升，细菌生长受影响；肠道发生炎症时，肠壁交感神经受到抑制，肠壁血管发生充血，肠腔膨胀扩张，造成肠黏膜局部缺血、缺氧和小肠绒毛坏死、脱落；肠粘膜摄取谷氨酰胺减弱，肠粘膜修复能力降低。这些因素均可加剧NASH患者肠道菌群失调。NASH患者肠道内菌群失调，肠道革兰阴性杆菌过度生长繁殖，肠道抗定植能力下降，导致肠道原有的生物屏障受损，结果使肠道通透性明显增高，大量的细菌内毒素可通过损害的肠粘膜屏障进入门静脉。而此时已发生脂肪变的肝细胞处理内毒素的能力大大降低，于是内毒素便可顺利通过肝脏这第二道“防线”进入血液循环，形成IETM。而内毒素不仅直接损害肝细胞[9]，还可抑制新生肠上皮细胞的迁移而延迟肠上皮细胞修复因子对损伤肠黏膜的修复，继而出现局部肠黏膜破损[10]。与此同时，内毒素启动剌激肝脏库普弗细胞释放各种介质，包括细胞因子、脂类介质、活性氧中间体、活性氮中间体、蛋白酶类等，形成瀑布反应[11，12，13]。这些介质本身不仅可导致肠道通透性的增加[14]，而且一些炎症因子如肿瘤坏死因子与坏死性炎症及纤维化密切相关[15]，它们还可诱导产生大量血管活性物质NO，高浓度的NO可破坏肌动蛋白细胞骨架和松散细胞紧密连接，引起肠上皮通透性增大，结果导致肠粘膜缺血缺氧，肠粘膜屏障损害[4]。因此，一方面脂肪变的肝细胞已经相当脆弱，经受不住“二次打击”[16]，另一方面IETM诱导产生的大量炎性细胞因子进一步破坏肠粘膜屏障，致肠道通透性增加，加重已形成的IETM，结果形成恶性循环，加剧脂肪性肝炎。

本实验采用的微生态制剂含有屎肠球菌和枯草杆菌两种活菌。屎肠球菌对致病菌抑制作用强、繁殖迅速。枯草杆菌属过路菌，其作用机制是利用生物夺氧作用，其在肠道定植降低了局部氧浓度和氧化还原电位，造成适合厌氧菌群的生长环境，促进双歧杆菌等的生长[17]。枯草杆菌还能产生多种消化酶，促进消化吸收，并能产生多种抗菌化合物，抑制变形杆菌属、大肠埃希菌、葡萄球菌属等有害菌，从而抑制革兰阴性杆菌及致病菌的生长[18]。与传统微生态制剂相比，通过将耐胆盐的屎肠球菌与耐酸的枯草杆菌结合而制成的肠溶制剂，能在消化道中存活，活菌数量大，且能与抗生素合用，从而最大限度地发挥其生物学效应，确保了治疗的有效性。研究表明美常安还具有抗脂质过氧化反应等作用[19]。因此，对NASH有治疗作用。本研究显示美常安干预前后，患者DAO、D-乳酸、内毒素及ALT水平显著降低，而对照组并无显著改变，提示美常安能促进肠道菌群的修复及平衡，在一定程度上解决了肠道菌群失调及肠道革兰阴性杆菌过度生长的问题，改善了微生态失衡，修复了受损的肠粘膜屏障，使肠粘膜通透性显著降低，IETM也随之降低，进一步抑制了肝脏库普弗细胞产生细胞因子对肝脏的“二次打击”，因而NASH患者的炎症得到改善，ALT降低。我们在试验中还观察到虽然ALT有一定程度的降低，但ALT仍远大于正常值，这可能由于NASH的发病是多因素共同作用的结果，只进行单一的肠道干预治疗可能疗效并不理想。

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