肝复康对大鼠肝组织血小板衍生生长因子表达及对胶原合成的影响*

李 骢 周 情 姜妙娜 张彩华 贾玉杰

血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是目前已知多肽生长因子中对肝星状细胞（HSC）作用最强的有丝分裂原[1-4]，在肝纤维化发生发展中起着非常重要的作用。我们观察了肝复康对大鼠肝组织PDGF表达的影响。

材料与方法

一、实验动物和细胞 健康SD大鼠（雌雄不限），体重180～220克，清洁级，由本校动物实验中心提供。HSC-T6细胞株由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠，表型为活化的HSCs。

二、药物及含药血清的制备 同前报道。

三、肝纤维化动物模型的制备 随机将大鼠分为正常对照组、模型组和肝复康治疗组。在造模时，皮下注射以橄榄油稀释的10%四氯化碳（5ml.kg-1），每周两次，共12周。正常对照组以同样方法皮下注射生理盐水。其中肝复康治疗组于造模第9周后开始用肝复康（溶于10ml/kg生理盐水）312.5mg.kg-1.d-1灌胃至20周，而正常对照组和模型组则以等容量的生理盐水灌胃。于21周末处死动物，迅速取出肝组织，称取肝脏湿重,置-70℃冰箱保存备检。

四、HSC-T6细胞培养 将传代培养的HSC按常规方法接种于6孔板中，分为正常对照组：加10%对照血清的DMEM；模型组：10%对照血清＋PDGF（终浓度60ng／ml）的DMEM；肝复康治疗组：10%药物血清＋PDGF（终浓度60ng／ml）的DMEM。以上各组均培养24小时，分别收集细胞。

五、大鼠肝组织PDGF-BB表达的检测 采用SP法，兔抗鼠PDGF-BB多克隆抗体（工作浓度1：400）购自北京博奥森生物技术有限公司。

六、肝组织及HSCsⅠ型胶原mRNA检测 采用RT-PCR法。引物由华大基因研究中心合成。引物详见表1。

表1 引物序列

七、统计学处理 应用 SPSS 13.0软件，所有数据均用表示，采用单因素方差分析，然后用LSD法进行两两比较。P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著性统计学差异。

结果

一、中药对大鼠血清生化指标的影响 模型组大鼠血清ALT、AST和球蛋白含量明显高于正常对照组，白蛋白和白/球比明显低于正常对照组（P＜0.01）；肝复康治疗组大鼠血清ALT、AST水平及血清球蛋白水平均明显降低，与模型组相比有显著性差异（P＜0.01）；治疗组大鼠血清白蛋白和白/球比水平明显上升，与模型组相比有显著性差异（P＜0.01，表2）。

表2 各组血清生化指标（）的比较

表2 各组血清生化指标（）的比较

与模型组比，①P＜0.01

组别 只 ALT（U/L）AST（U/L）白蛋白（g/L）球蛋白（g/L） 白球比对照组 12 20.26±6.12① 42.75±10.19① 42.03±5.17① 23.45±4.61①1.91±0.24①模型组 11 74.19±11.74 89.63±11.97 26.41±3.79 34.42±2.53 0.91±0.30治疗组 12 28.73±7.59① 47.01±10.72① 40.92±6.38① 24.93±4.43①1.61±0.41①

二、肝复康对大鼠肝组织PDGF-BB蛋白表达的影响 在正常组大鼠肝细胞PDGF-BB呈弱表达；模型组大鼠肝组织PDGF-BB呈强阳性表达，主要见于纤维间隔区，尤其见于纤维间隔和炎性细胞浸润区，细胞内有粗糙的阳性团块表达；与模型组相比，治疗组大鼠肝组织PDGF-BB阳性细胞数量则明显减少。对PDGF-BB蛋白光密度积分分析，发现模型组PDGF-BB的表达（0.297±0.01）显著高于正常组（0.229±0.03，P＜0.01）；治疗组 PDGF-BB 表达（0.231±0.04）较模型组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），而治疗组与正常对照组比较，无统计学差异（图1）。

图1 大鼠肝组织PDGF-BB表达情况（SP，×400）

三、肝复康对肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平的影响 正常组大鼠肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平较低；模型组大鼠肝组织则明显上升，与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）；治疗组大鼠肝组织较模型组明显下降，有显著性差异（P＜0.01），但与正常对照组相比无统计学差异（P＞0.05，图 2、3）。

图2 肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平

图3 肝组织β-actin mRNA水平

四、肝复康对HSCsⅠ型胶原mRNA水平的影响 在未加入PDGF刺激的正常对照组，细胞Ⅰ型胶原mRNA呈相对低水平；在加入对照血清及PDGF刺激的模型组，细胞Ⅰ型胶原mRNA水平与正常对照组相比明显上调（P＜0.01）；药物治疗组与模型组比，由PDGF刺激诱导的Ⅰ型胶原mRNA水平明显下降（P＜0.01，图 4）。

图4 HSCsⅠ型胶原mRNA水平

讨论

肝纤维化的发生机制是十分复杂的病理生理学过程，主要由于ECM过度增生及降解减少所致。HSC在肝纤维化的发生发展中起重要作用[5，6]。许多细胞因子可作用于HSC，经多种信号转导途径使其激活[7，8]，并转化为肌成纤维细胞。PDGF能够强烈刺激HSC[9，10]，使其活化，并分泌大量ECM，沉积于肝脏。这也是肝纤维化形成的关键。PDGF主要有三种形式的二聚体亚型，即PDGF-AA、PDGF-BB及PDGF-AB。二聚体之间通过三对二硫键相连接[11]。最近还发现了PDGF家族的新成员PDGF-C和PDGF-D。目前的研究表明，他们与恶性肿瘤的形成和胚胎发育有关[12]。PDGF必须与细胞膜上的相应受体结合后才能发挥其生物学效应。PDGF受体（PDGFR）分子由 α（PDGFR-α）及 β（PDGFR-β）两种亚单位组成，在肝纤维化时HSC表面的PDGF受体以β受体为主，该受体与PDGF-BB具有较强的亲和力，故PDGF-BB在肝纤维化过程中的作用尤为突出[13，14]。有研究发现在肝纤维化时，PDGF-BB mRNA水平明显上调[15]。本实验结果显示，模型组大鼠肝组织PDGF-BB阳性细胞数目明显增多，这与以往所报道的PDGF-BB在肝纤维化发生中的作用相符。

中药肝复康的主要成分有丹参（活血化瘀）、柴胡、当归（补血合血）、黄芪（益气）、赤、白芍（活血化瘀）等。本课题组多年来已经证实其对肝纤维化具有很好的治疗作用[16]。本实验结果显示，与模型组相比，治疗组大鼠血清ALT、AST和球蛋白水平明显下降，白蛋白和白/球比明显升高；免疫组织化学染色显示治疗组肝组织PDGF-BB阳性细胞数较模型组明显减少。此外，应用肝复康治疗后，肝组织和HSC中Ⅰ型胶原mRNA水平较模型组也明显下调。因此，本研究通过体内和体外实验均证实，肝复康通过降低PDGF的表达，抑制了Ⅰ型胶原的合成，缓解了肝纤维化的程度。

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