烟草野火病菌拮抗细菌的筛选及其应用研究

文景芝，杨晓敏，李樱梅，孙剑萍

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.牡丹江烟草科学研究所，黑龙江 牡丹江 157011）

由丁香假单胞杆菌烟草致病变种[Pseudomonas syringae pv.tabaci（World et Foster）Young et al.]引起的烟草野火病属暴发性、毁灭性细菌病害[1]，其发生严重影响烟草的品质和产量。该病最早于1917年由美国人Wolf和Foster报道，1917～1918年野火病成为美国北卡州危害最严重的病害[2]。近年来，该病在我国云南、贵州、河南、山东、湖北、辽宁和吉林等省烟草种植区均大面积发生，并有逐年加重的趋势。目前该病害在抗病育种方面虽然取得一些进展，但研究表明中国推广的烤烟品种长脖黄、NC82、G140、G28、K326、红花大金元等均不抗野火病[3]。目前生产上最常用的药剂为农用链霉素，虽对该病害防效较好，但连续使用不仅造成环境污染和残留问题，对烟叶出口和卷烟安全带来不利影响，而且使病原菌产生抗药性，因此生物防治越来越受到人们的关注。当前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌（Bacillus spp.）、假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobacter）以及其他一些细菌[4]。目前已筛选出对野火病菌有抑制作用的株系和对病菌有很高活性的放线菌类型C-25，A/60c-7/2和C-7/20，而且在美国放射形野杆菌（Radial field bacillus）菌系K84已进入商品化应用[5]。丁爱云等筛选出对野火病拮抗活性较强的菌株，其中细菌2株，放线菌2株，但国内在野火病的生物防治方面仍停留在室内试验阶段，研究还不够深入[6]。考虑到从烟叶中分离到细菌更容易定殖于烟叶中，因此本研究从不同品种的健康烟叶中分离大量细菌，从中筛选对野火病菌表现较强拮抗能力且抑菌效果稳定的菌株，对其进行16S rDNA鉴定，并进行发酵条件优化，测定发酵液的田间防效。为测定拮抗细菌在烟草叶片中的定殖能力，本研究对拮抗细菌进行利福平抗性诱导试验，为生物农药的开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）由牡丹江烟草科学研究所提供。

细菌的分离培养采用NA培养基；细菌的发酵培养采用NB培养液；细菌的保存采用PDA培养基。培养基配方参照文献[7]。

1.2 烟草叶片的采集与细菌的分离

从牡丹江烟草科学研究所试验田采集不同品种健康烟叶30份，分别取2 g叶片研磨，采用平板稀释分离法分离叶片内外的细菌[8]。挑取不同类型单菌落在NA平板上划线纯化培养，将单菌落转接到PDA斜面上编号培养后，保存待用。

1.3 烟草野火病菌拮抗细菌的筛选

拮抗细菌的筛选：将混有5%病原菌发酵液的培养基冷却成平板。吸取70 μL待测细菌菌悬液在平板上划线[9]，以无菌培养液划线为对照，28℃培养2～3 d后观察抑菌效果，测量抑菌带宽度。对于有抑菌效果的进行皿内复筛，检测其遗传稳定性，方法同上。

拮抗细菌的纯培养[10]：把稀释10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固体培养基平板，培养一段时间后形成单菌落。挑选长势好、菌落饱满的菌株用连续划线法对细菌纯化培养，保存待用。

1.4 拮抗细菌菌株的鉴定

拮抗菌株的形态观察及生理生化特性鉴定，参照文献[11]。

拮抗菌株的16S rDNA鉴定：采用Schroth等的方法提取拮抗细菌菌株总DNA[12]，并稍作改进。采用细菌16S rDNA V3区通用引物对F338GC和R518（引物由上海生工合成）进行PCR。PCR反应体系：dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×buffer（含 MgCl2）5 μL，引物 F338GC 和 R518（25 μmol·L-1）各 1 μL，TaqDNA 酶 1 μL，模板 2 μL（200 ng·μL-1），无菌去离子水39.5 μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min，94℃ 10 s，62℃ 20 s，66℃40 s，68℃ 7 min，35个循环。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物交上海生工测序，将测得的16S rDNA序列与GenBank数据库序列进行BLAST分析比对，确定拮抗细菌菌株的分类地位。

1.5 拮抗细菌菌株的利福平抗性标记

参照杜立新等的方法并稍加改进[13]。首先在NA平板上活化拮抗细菌菌株，挑取单菌落在含有利福平5 μg·mL-1的NB培养基中28℃下震荡培养2 d，然后在含有5 μg·mL-1利福平的NA平板上培养，待长出菌落后，逐级提高利福平浓度进行诱导培养，使菌株逐渐适应高浓度利福平。用NA平板拮抗试验验证抗药菌株对烟草野火病菌的拮抗性，以原始菌株为对照。

1.6 拮抗细菌发酵条件的优化

1.6.1 发酵液中拮抗细菌活菌数与菌液吸光度的相关性测定

将拮抗细菌菌悬液用无菌水稀释成10-4、10-5、10-6、10-7四个浓度，采用UV-8000紫外分光光度计测定各浓度菌悬液OD625值，同时在NA平板上加入各浓度菌悬液100 μL，用涂布器涂匀，28℃下培养2 d，计测各浓度菌悬液的菌落数，计算单位体积活菌数和吸光值与活菌数的相关性。

1.6.2 单因子试验

在发酵条件初筛的基础上，选取不同单一碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、木糖、麦芽糖、甘油、乳糖、蔗糖和甘露醇，用量0.5%）；在碳源不变情况下，选取不同单一有机氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和胰蛋白胨，用量1%）和不同单一无机氮源（NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl和KNO3，用量1%），并进行两种较优有机氮源的组合配比试验；在较优碳源、氮源情况下，加入不同量的NaCl（0.1%、0.3%和0.5%）；较优碳源、氮源和NaCl中，加入不同量的无机氮源（0.1%、0.3%和0.5%）。测定各条件下菌悬液OD625值及其对烟草野火病菌的抑菌活性。

1.6.3 培养基优化正交试验

依据单因子试验结果，选取较优不同碳源浓度（0.1%、0.3%和0.5%）、较优不同有机氮源浓度（0.5%、1%和2.0%）、较优无机不同氮源浓度（0.1%、0.3%和0.5%）、不同NaCl浓度（0.1%、0.3%和0.5%），进行4因素3水平的正交试验，28℃下震荡培养2～3 d。测定各条件下菌悬液OD625值及其对烟草野火病菌的抑菌活性。

1.6.4 培养条件的优化试验

采用优化后的发酵培养基，在不同培养温度（25、28、33、36和39℃）、不同培养基pH（4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0）、不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%、8%和10%）和不同通气量（250 mL三角瓶中分别装20、30、40、50、60、70和80 mL）条件下培养拮抗细菌菌株，28℃培养2～3 d后，测定各条件下菌悬液OD625值及其对烟草野火病菌的抑菌活性。

1.7 拮抗细菌发酵液的田间药效试验

本试验于2010年6～7月在牡丹江烟草科学研究所试验场烟田进行，每小区有团棵期烟株15株。共设3个处理：A-拮抗菌活菌发酵液（6倍稀释液，约6×108cfu·mL-1）；B-拮抗菌优化发酵液（6倍稀释液，约6×108cfu·mL-1）；C-药剂甜叶桔（3 000倍稀释液）；D-清水对照。采用随机区组排列，重复3次。采用高压喷雾法喷雾（每处理喷施2 L），隔天重新喷1次。2 d后各处理喷施病原菌，每处理喷施2 L。喷施病原菌后保湿，第5天、第10天按照中华人民共和国烟草病害分级标准（YC T 39-1996）[3]分别调查，每小区调查10株，每株调查中下部叶片10片，计算病情指数及防治效果。

2 结果与分析

2.1 烟草野火病菌拮抗细菌的筛选

从健康烟草成熟叶片中分离到细菌287株，其中14株对烟草野火病菌具有一定拮抗作用，抑菌带宽度在3.6～9.3 mm之间。其中菌株Y32的抑菌效果最好，并且抑菌效果稳定（见图1-A），至少达10代左右。

2.2 菌株Y32的鉴定

菌株Y32的形态特征观察结果表明，菌株Y32在NA培养基上生长良好，菌落形态为圆形或近圆形，突起，乳白色，不透明，不产生色素。其生理生化特性为：运动性试验、葡萄糖氧化发酵、M.R.试验、V.P.试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶试验、淀粉水解试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验以及明胶液化试验均为阳性，且NaCl含量为2%、5%、7%、10%时菌株生长良好，吲哚试验为阴性。上述特性与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）完全一致，初步确定该菌株为枯草芽孢杆菌。

菌株Y32 16S rDNA测序结果如下：GCTATGC AATACTTACCTGCAATAGTGACGAAAGTCTGGAC GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA CCGTTCGAATAGGGCGGTGCCTTGACGGTACCTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATAAAAA。此序列与GenBank中已报道的序列同源性比较结果表明，Y32与枯草芽孢杆菌 MSB10（Bacillus subtilis MSB10）的同源性达到96%，证明该菌属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3 拮抗细菌Y32的利福平抗性标记

试验最终培养出抗80 μg·mL-1利福平的标记菌株，记为Y32标记。该标记菌株对烟草野火病菌的拮抗作用如图1-D所示，表明Y32标记菌株对烟草野火病菌的拮抗效果显著低于原始菌株，而且在培养过程中出现拮抗细菌生活力下降、拮抗活性降低、菌体变透明等现象，与原始菌株不同，而且无法计数，因此不能作为进一步研究拮抗细菌在烟草植株体内定殖试验的材料。

2.4 拮抗细菌发酵条件的优化

2.4.1 发酵液中拮抗细菌的活菌数与菌液吸光度的相关性

发酵液中拮抗细菌的活菌数量与其OD625值呈线性关系，线性方程为y=1.4541x+6.4316，r2=0.9393，因此可以用发酵液的OD625值代表发酵液中的拮抗细菌活菌数。以下试验均用发酵液的OD625值来表示发酵液中的拮抗细菌活菌数。

2.4.2 单因子试验

试验结果表明，最佳碳源为葡萄糖，最适浓度为0.1%；单一氮源以蛋白胨和酵母膏为宜，其中0.5%酵母膏+0.3%蛋白胨的配比抑菌效果最好，且组合浓度为1%时拮抗细菌的产量最大，且抑菌带最宽；无机氮源以0.5%KNO3最好；一定量的NaCl能促进拮抗细菌的生长，并能提高拮抗细菌的抑菌活性，其中以0.3%NaCl效果最好。

2.4.3 培养基优化正交试验

以抑菌带宽为指标，得出拮抗细菌的实验室最佳发酵配方为：氮源（酵母膏∶蛋白胨=5∶3）1%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%。通过培养条件优化试验，结果得到抑菌带宽度达到16.8 mm（见图1-B），大于正交试验结果中的最高值11.4mm。

图1 菌株Y32对烟草野火病菌的拮抗效果Fig.1 Effect of Y32 against Pseudomonas syringae pv.tabaci

2.4.4 培养条件的优化

试验结果显示，使拮抗细菌的生长量最大、且抑菌带最宽的培养条件为：温度28℃、pH 7.0～7.5、接种量4%、装液量250 mL三角瓶装50 mL。

2.5 Y32发酵液对烟草野火病的田间药效

试验结果见表1。Y32菌株优化发酵前防效为60.7%，显著好于药剂甜叶桔的防效45.3%，优化发酵后的防效为71.6%，比优化发酵前提高了10.9%，显著高于其他处理。

表1 Y32发酵液对烟草野火病的田间药效Table1 Field effect of Y32 fermentation liquid against tobacco wildfire disease

3 讨论与结论

拮抗菌筛选方法中，最常用的有平板划线法、抑菌圈法和琼脂块法[8]。由于本试验中病原菌和所筛选的拮抗菌均为细菌，在以上方法的基础上，将病原菌与待测细菌均制成菌悬液再进行拮抗性鉴定，这种方法观察结果更加直观、快速。由于细菌在离体条件下拮抗作用与自然环境下防病作用往往不存在必然联系，因此本试验又将筛选出的拮抗效果较好的Y32菌株进行田间试验，防效较多。

细菌是目前人们研究的一类重要生防菌，能够产生细菌素、抗生素及次生代谢产物等活性物质，对病原菌具有很强的抑制作用，具有广泛的用途和巨大的经济价值。已开发出大量优良生防菌株进行商品化应用，取得了可观的生态效益[14]。本试验筛选出的枯草芽孢杆菌Y32对烟草野火病菌具有很强的拮抗作用。通过发酵条件优化和培养基成分正交试验，明确其最佳的发酵配方为：氮源1%（酵母膏∶蛋白胨=5∶3），葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%；最佳培养条件为：发酵温度28℃，培养基pH 7.0～7.5，接种量4%，装液量250 mL三角瓶装液50 mL。其最佳发酵条件的确定，为以后活性物质的进一步研究和生物农药的开发奠定基础。

拮抗细菌能否在目标植株内定殖是生防菌取得防效的关键[14]，研究拮抗细菌在植株体内定殖的方法主要有抗利福平、氨苄青霉素和卡那霉素等抗菌素标记法及电镜观察法、抗血清法和免疫胶体金染色法等[15]。本试验虽然获得了利福平抗性标记菌株，但由于该标记菌株对烟草野火病菌的抑制作用显著低于野生菌株，并且在培养基上菌落呈透明状，已经不能代表原来的野生菌株，因此认为利福平抗性标记不适于研究拮抗细菌在烟草叶片中的定殖能力，其他标记方法有待研究，如绿色荧光蛋白标记方法，本研究将针对此方法进一步进行该生防菌的定殖研究。

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