丝胶对糖尿病大鼠脊髓及脊神经节细胞神经生长因子表达的作用

赵晓丽 张延红 张风侠 王 冬 钟美蓉陈志宏

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

丝胶对糖尿病大鼠脊髓及脊神经节细胞神经生长因子表达的作用

赵晓丽 张延红 张风侠 王 冬 钟美蓉1陈志宏1

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

目的 探讨丝胶对2型糖尿病大鼠脊髓及脊神经节细胞神经生长因子(NGF)表达的作用。方法 36只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组(n=12)。采用SP法观察坐骨神经对应脊髓节段(L4～6)和脊神经节细胞NGF蛋白的表达。结果 NGF蛋白免疫阳性产物为棕黄色细腻颗粒状，位于脊神经节细胞和脊髓前角细胞的胞质和胞核，以胞质为主。与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF蛋白的表达明显降低(P＜0.01);与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠脊髓前角细胞、脊神经节细胞NGF蛋白的表达明显升高(P＜0.01)。结论 丝胶上调脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF的表达，保护糖尿病坐骨神经相关神经元胞体。

丝胶;糖尿病;脊髓;脊神经节;NGF

当前治疗糖尿病周围神经病变大都以控制血糖为主，并辅以营养神经及活血化瘀等药物，但控制血糖的西药的毒副作用不容忽视。蚕茧为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳，性甘、温，无毒，主治多饮、不生肌肉、肾消白浊和上中二消。民间有蚕茧泡水降血糖的验方，本课题组的前期研究亦发现，丝胶可有效降低血糖、保护糖尿病肾脏损伤〔1〕。本研究探讨丝胶对2型糖尿病大鼠坐骨神经相关神经元胞体的保护作用，为治疗糖尿病周围神经损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成;链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司;兔抗NGF多克隆抗体，美国Santa Cruz公司。

1.2 实验动物分组及处理 健康清洁级3月龄雄性SD大鼠36只，体质量200～250 g(合格证号:712024)，购自河北医科大学实验动物中心。随机选取其中的12只作为正常对照组，常规饲养，不做任何处理;其余的24只采用小剂量STZ连续腹腔注射(2%STZ，25 mg/kg，3 d)的方法建立2型糖尿病大鼠模型，以血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准〔2〕;待模型成功建立后再随机分为糖尿病模型组和丝胶治疗组，糖尿病模型组大鼠不再做任何处理，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃，连续35 d。

1.3 检测血糖 各组大鼠用药结束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦采血，离心后收集血清。应用Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4 神经生长因子(NGF)蛋白表达的检测及定量分析 大鼠取血后断头处死，分别取坐骨神经对应节段脊髓(L4～6)和脊神经节，入Bouins液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。采用SP免疫组织化学染色法观察脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF蛋白的表达。一抗稀释浓度1:50，DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照;以脊髓前角细胞和脊神经节细胞胞核、胞质出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒为NGF阳性反应。采用MiVnt图像分析系统在10×20倍显微镜下对免疫组化阳性结果进行定量分析，以免疫阳性产物面积占视野面积的比值作为NGF蛋白的相对表达水平。每组随机选取6只大鼠，每只大鼠选取6张切片，每张切片随机选3个视野，取平均值。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖 糖尿病模型组大鼠的血糖明显高于正常对照组大鼠(P＜0.01)，丝胶治疗组大鼠的血糖为明显低于糖尿病模型组大鼠(P＜0.01)。见表1。

2.2 大鼠脊髓前角细胞、脊神经节细胞NGF蛋白的表达NGF蛋白免疫阳性产物为棕黄色细腻颗粒状，位于脊神经节细胞和脊髓前角细胞的胞质和胞核，以胞质为主(图1);NGF蛋白定量分析结果见表1。与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF蛋白的表达明显降低(P＜0.01)。与模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF蛋白的表达明显升高(P＜0.01)。

表1 各组大鼠血糖、脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF的表达(±s，n=12)

表1 各组大鼠血糖、脊髓前角细胞和脊神经节细胞NGF的表达(±s，n=12)

糖尿病模型组:1)P＜0.01

组别 血糖(mmol/L) NGF表达脊髓前角细胞 脊神经节细胞正常对照组 10.83±2.031) 0.118 5±0.023 81) 0.411 8±0.035 31)糖尿病模型组 29.45±4.82 0.040 8±0.006 9 0.217 6±0.031 9丝胶治疗组 13.20±4.01) 0.086 7±0.020 31) 0.295 2±0.052 21)

图1 各组大鼠脊髓前角及脊神经节细胞NGF的表达(DAB，×200)

3 讨论

目前，糖尿病周围神经病变的机制尚不十分明了，研究发现多种因素参与了糖尿病周围神经病变的发病过程〔3〕:体内多元醇代谢通路活性增强，醛糖还原酶活性明显提高，多元醇在细胞内大量蓄积，导致蛋白激酶-C和Na+-K+-ATP酶活性降低，Na+在神经纤维间滞留，神经传导速度减慢;神经组织缺血、缺氧或过氧化;微管、微丝及神经结构蛋白的非特异性糖基化;神经营养因子及其他生长因子相对缺乏。上述因素与糖尿病微血管病变相互作用，形成“恶性循环”，导致雪旺氏细胞代谢紊乱，神经纤维节段性脱髓鞘，严重者神经纤维萎缩变性。

由靶细胞合成释放的NGF通过旁分泌的方式与神经末梢上的高亲和力受体(TrKA)和低亲和力受体(p75)结合，通过轴浆逆行运输至胞体，发挥诱导神经细胞合成蛋白质、抑制神经元凋亡、诱导轴突生长、促进神经鞘磷脂水解和神经纤维再生等多种功能〔4〕。关于NGF与糖尿病周围神经损伤之间的关系，有学者研究发现无论是糖尿病患者还是糖尿病动物模型，多种组织均出现NGF表达水平下降，原因可能与胰岛素缺乏和高血糖状态使NGF合成减少、受体(TrKA)亲和力降低及NGF逆向轴浆运输受损有关〔5〕。

糖尿病周围神经病变在糖尿病的基础上发展而来，以脏腑阴虚燥热、气阴两虚、津液疏布失常为基础，随着病程的延长，日久导致癖血阻滞经络，出现肢体疼痛、麻木等诸多表现。民间有蚕茧泡水降血糖的验方。一根茧丝由两根单丝纤维平行黏合而成，每根单丝又由中心丝素和外围丝胶构成。起源于我国的蚕丝业拥有几千年的悠久历史，但对蚕丝的应用主要集中于丝素方面，丝胶约占茧丝的30%，在缫丝和精练时极大部分作为废料而丢弃。丝胶为天然高分子水溶性蛋白，由18种氨基酸组成，以丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸为主。本研究发现，糖尿病模型组大鼠脊神经节细胞和脊髓前角细胞NGF的表达明显低于正常组大鼠，这与前人的研究结果一致。丝胶治疗组大鼠脊神经节细胞和脊髓前角细胞NGF的表达较模型组明显上调，表明丝胶可通过降低血糖，增加靶细胞NGF的合成，提高NGF受体亲和力，促进轴浆运输等，发挥对糖尿病神经病变的保护作用。

1 宋成军，郝祥俊，陈志宏.丝胶对糖尿病肾病大鼠肾功能和肾脏TIMP-1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(15):2157-9.

2 Xiang X，Wang Z，Zhu Y，et al.Dosage of streptozocin in inducing rat model of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Wei Sheng Yan Jiu，2010;39(2):138-42.

3 Zochodne DW.Diabetic neuropathies:features and mechanisms〔J〕.Brain Pathol，1999;9(2):369-91.

4 Hannila SS，Kawaja MD.Nerve growth factor-mediated collateral sprouting of central sensory axons into differentiated regions of the dorsal horn is enhanced in the absence of the p75 neurotrophin receptor〔J〕.J Comp Neurol，2005;486(4):331-43.

5 Kanbayashi H，Itoh H，Kashiwaya T，et al.Spatial distribution of nocieptive neuropeptide and nerve grow the factor depletion in experimental diabetic peripheral nervous system〔J〕.J Int Med Res，2002;30(5):512-9.

〔2011-08-23收稿 2011-12-12修回〕

(编辑 曹梦园)

Effects of sericine on nerve growth factor expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells

ZHAO Xiao-Li，ZHANG Yan-Hong，ZHANG Feng-Xia，et al.
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To investigate the effects of sericine on nerve growth factor(NGF)expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells.Methods 36 male SD rats were randomly divided into normal control，diabetes model and sericine treatment groups(n=12).SP immunohistochemical staining was used to observe the NGF protein expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells.Results NGF protein immunopositive products were buffy exquisite granules，located at the cytoplasm and nucleus of anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells，mainly at cytoplasm.Compared with normal control rats，the NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells of rats in diabetes model group were decreased significantly(P＜0.01).Compared with diabetes model rats，the NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and spinal ganglia cells of rats in sericine treatment group were increased obviously(P＜0.01).Conclusions Sericine can protect sciatic nerve correlated neuronal soma of type 2 diabetes rats by up regulating NGF expressions in anterior horn cells of spinal cord and sciatic nerve.

Sericine;Diabetes mellitus;Spinal cord;Spinal ganglia;Nerve growth factor

R587

A

1005-9202(2012)17-3700-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.041

河北省教育厅项目(No.2006301);河北省科技厅项目(No.08276101D-9)

1 承德医学院人体解剖学教研室

陈志宏(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经解剖学研究。

赵晓丽(1964-)，女，副主任护师，主要从事神经电生理学研究。