眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马组织TNF-α表达的影响

关洪全 高 原 王素娟 王 哲 马贤德 赵金茹 王守岩 柴继严 王 健

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马组织TNF-α表达的影响

关洪全 高 原 王素娟 王 哲 马贤德 赵金茹 王守岩 柴继严 王 健

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

目的 观察眼针对大鼠脑缺血再灌注后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达的影响，以探讨眼针对缺血再灌注大鼠脑海马区细胞的保护作用及其作用机制。方法 健康SD大鼠，雌雄不拘，设正常对照组、假手术组、模型组、眼针组;采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，选取眼穴肝区、肾区、上焦区、下焦区，平刺，进针3 mm，留针20 min;分别于脑缺血再灌注后3、24、72 h处死动物并取材;应用蛋白质印迹法(Western印迹)检测海马组织中TNF-α蛋白的表达。结果 眼针组海马组织TNF-α在脑缺血再灌注后3、24、72 h均较模型组明显降低，差异显著。结论 眼针疗法可以降低脑缺血再灌注模型大鼠海马组织TNF-α的表达，进而抑制由脑缺血再灌注诱导的炎症反应，发挥脑保护作用。

眼针;缺血再灌注;肿瘤坏死因子-α;海马

眼针疗法是辽宁中医药大学附属医院彭静山老先生发明的一种针刺疗法，临床应用多年，对缺血性脑卒中等疾病具有很好的疗效，但其机制尚未阐明。脑缺血再灌注损伤主要与氧化应激反应、炎性反应、钙超载、脑水肿和细胞凋亡等有关。炎性反应在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种具有广泛生物学功能的炎症介质，在脑组织缺血再灌注后引起的炎症反应、细胞凋亡等组织损伤中发挥重要作用〔1～3〕。本研究通过观察眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑海马组织匀浆中TNF-α蛋白表达的影响，探讨其脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康SD大鼠96只，雌雄不拘，体重(280±20)g，由北京维通利华实验动物中心提供。实验前适应性喂养1 w，自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、眼针组，再根据缺血再灌注损伤时间分设3 h、24 h、72 h亚组，每亚组8只。

1.2 模型制备与评价 模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，模型制作按照文献〔4〕记载方法进行。模型成功标准:大鼠于缺血2 h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照Longa 5分制评分标准〔5〕:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型组、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1 cm，其他同手术组。正常组未处理。

1.3 眼针取穴及刺法 眼针组:用31号13 mm毫针，于大鼠眶周2 mm处针刺，定位参照人体取穴方法〔6〕，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。手法:平刺，进针3 mm。留针10 min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。治疗时间:3 h针刺组于脑缺血再灌注即刻及其取材前30 min，分别进行眼针治疗;24 h、72 h针刺组于脑缺血再灌注即刻及其取材前30 min分别进行眼针治疗，除此之外每12 h针刺1次。见图1。

图1 大鼠眼针取穴示意图

1.4 试剂及实验用药 亲和纯化兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 检测方法 海马组织TNF-α蛋白表达(Western印迹法)检测:分别于缺血再灌注损伤3 h、24 h、72 h给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，去掉小脑，沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开，剥离出病变侧海马，按海马组织净重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，pH7.5，将样品剪碎后匀浆、离心，上清即为总蛋白。兔抗鼠TNF-α 一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 显色;扫描仪扫描NC膜，分析结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件分析，实验数据均采用±s表示，采用方差分析进行比较。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等;假手术组大鼠无神经功能障碍表现。与模型组比较，眼针组再灌注损伤3 h、24 h、72 h后神经功能缺损评分均有差异(P＜0.01)。见表1。

表1 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点神经功能缺损评分的影响(±s，n=8)

表1 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点神经功能缺损评分的影响(±s，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.01

组别3 h 24 h 72 h模型组2.625±0.916 1 3.125±0.640 9 2.625±0.744 0眼针组 1.500±0.534 51)1.500±0.534 51)1.625±0.517 51)

2.2 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马组织TNF-α蛋白表达的影响 采用Western印迹方法检测大鼠右侧海马TNF-α蛋白，以β-αctin为内参，模型组TNF-α蛋白表达强度明显强于正常组和假手术组，眼针组表达明显低于模型组，均有显著差异(P＜0.05)。见图2、表2。

表2 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马组织TNF-α蛋白表达的影响(±s，n=8)

表2 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马组织TNF-α蛋白表达的影响(±s，n=8)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别3 h 24 h 72 h正常组0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3假手术组 0.694 5±0.083 8 0.686 3±0.030 0 0.616 7±0.042 6模型组 1.039 4±0.065 71)1.086 8±0.037 61)1.120 8±0.040 01)眼针组 0.843 2±0.052 92)0.766 9±0.035 22)0.711 9±0.032 72)

图2 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点海马TNF-α蛋白表达的影响

3 讨论

TNF-α是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，参与机体免疫应答和炎症反应。研究表明，有许多种促炎细胞因子在脑缺血损伤后高度表达，TNF-α是较早释放的具有多种生物效应的重要促炎细胞因子，在炎症反应过程中发挥级联放大反应的作用，可以激活细胞因子诱导白介素和次级炎症介质的合成。脑缺血再灌注后，TNF-α在损伤区域大量表达，除循环性巨噬细胞外，缺血神经组织内的神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞、小胶质细胞亦是TNF-α的重要来源，TNF-α在脑组织中高表达具有神经毒性，可加速神经细胞的死亡〔7〕。

本实验结果显示，正常组和假手术组大鼠海马组织仅见少量TNF-α表达，说明TNF-α在正常海马组织中低含量存在，可能与神经细胞的正常维护有关。模型组大鼠海马组织TNF-α蛋白表达在缺血再灌注3 h开始升高，随着缺血再灌注时间的延长，24 h明显升高，72 h升高达高峰，表明脑缺血再灌注后72 h内，缺血海马组织的神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞、小胶质细胞分泌TNF-α随着时间的延长而逐渐增多，导致海马组织的缺血性损伤，且TNF-α的表达与海马组织的损伤程度呈正相关。给予眼针治疗后，大鼠海马组织TNF-α蛋白表达明显下降，说明眼针在海马组织缺血再灌注中能够抑制TNF-α的表达，减轻其对脑组织的损伤。

眼针是在眼眶周围针刺以治疗全身疾病的一种微针技术，是针灸施术的一种特殊针法。中医认为，脑为奇恒之府，脑由髓汇集而成，故名“髓海”，脑是精髓和神明高度汇集之处，有元神之府。眼与脑密切相连。……目形类丸，……内有大络六，谓心、肺、脾、肝、肾，命门各主其一;中络八，谓胆、胃，大小肠，三焦、膀胱各主其一;外有旁支细络莫知其数，皆悬贯于脑……〔8〕。说明眼通过经络与脑密切相连。“五脏六腑之精气，皆上注于目，而为之晴。精之窠为眼……其窠气之精为白眼，肌肉之精为约束。裹撷筋骨血气之精，而与脉并为系，上属于脑，后出于项中，故邪入于项，因逢其身之虚，其入深，则随目系以入脑”〔9〕。“八廓应乎八卦，脉络经纬于脑，贯通脏腑，以达血气，往来以滋于目”。说明眼与脑通过经络密切相连，生理上相互协调，病理上也是病邪传变的途径。中医学认为，缺血性中风是由于年老体虚，脏腑功能减退，气血运行不畅，淤血阻滞脑部络脉所致。刺针眼穴肝区、上焦区、下焦区、肾区，具有醒神开窍、活血通络作用。本实验证明，针刺上述穴位可通过直接抑制缺血性脑损伤大鼠海马组织TNF-α蛋白的表达来实现对脑细胞损伤的保护作用。

1 丁德光，李家康，罗惠平，等.电针对脑缺血再灌注大鼠缺血区皮质TNF-α mRNΑ 表达及TNF-α 含量影响〔J〕.中国中医急症，2007;16(6):695-7.

2 Rodríguez-Yáňez M，Castillo J.Role of inflammatory markers in brain ischemia〔J〕.CurrOp in Neurol，2008;21(3):353-7.

3 Schaller B，Graf R.Cerebral ischemia and reperfusion:the pathophysiologic concept αs α basis for clinical therapy〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2004;24(2):351-71.

4 马贤德，孙宏伟.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中华中医药学刊，2009;27(6):1200-1.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

6 彭静山.眼针疗法〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11.

7 李丹萍，易 莉，陈 强，等.针刺对脑缺血损伤级联反应和再灌注影响的研究进展〔J〕.中国康复医学杂志，2005;20(11):865-7.

8 王肯堂.证治准绳〔M〕.北京:中国中医药出版社，1997:226.

9 程士德.内经讲义·灵枢·大惑论〔M〕.上海:上海科技出版社，1984:56.

〔2011-03-17收稿 2011-06-15修回〕

(编辑 张永贵/胡国义)

The effect of eye acupuncture therapy on the expression of TNF-α of hippocampus at different time points in rats with cerebral ischemia reperfusion

GUAN Hong-Quan，GAO Yuan，WANG Su-Juan，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

Objective To investigate TNF-α expression at different time points in the brain of rats with cerebral ischemia-reperfusion(IR)injury，in order to discuss the mechanism of eye-acupuncture therapy and observe the intervention effects on the hippocampus.Methods Healthy SD rats，male and female，were randomly divided into normal，sham-operated control，model and eye-acupuncture groups.Sham-operated control，model and eye-acupuncture groups were divided into 3，24 and 72 h subgroups.The rat model of cerebral IR was established by suture method.Eye acupoint liver area，kidney area，upper jiao area and lower jiao area were selected and acupunctured horizontally，inserting needle in 3 mm deep，retaining needle for 20 min.All the animals were executed respectively at 3，24，72 h after reperfusion and draw materials.The method of immunohistochemistry and Western blot technology were taken to detect the changes of hippocampus TNF-α expression in rats after the eye-acupuncture therapy.Results Compared with that of model group，TNF-α expression in the hippocampus of rats of the eye-acupuncture group was significantly decreased obviously at 3，24，72 h after reperfusion.Conclusions The eye-acupuncture therapy could down-regulate hippocampus TNF-α expression in rats with cerebral IR injury，suppress inflammatory response induced by cerebral IR and play a role in protecting brain.

Eye acupuncture;Ischemia-reperfusion;Tumor necrosis factor-α;Hippocampus

R74

A

1005-9202(2012)17-3705-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.043

国家重点基础研究发展计划项目(No.2007CB512702)

王 健(1948-)，男，主任医师，主要从事中西医结合治疗缺血性脑血管病研究。

关洪全(1954-)，男，教授，主要从事中医药对免疫的调控研究。