5-氮-2’脱氧胞苷对食管癌细胞系KYSE220中CDH13基因甲基化的影响

陈礼忠* 於建鹏

（1 湖北省黄石市河口卫生院，湖北 黄石 435000；2 湖北省黄石市肿瘤医院，湖北 黄石 435000）

CDH13是一种抑癌基因，位于16q24，它的缺失和肿瘤发生密切相关[1]。已证实在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌中CDH13表达下调[2]。基因甲基化是可逆过程，逆转抑癌基因甲基化可恢复抑癌基因转录水平。5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）是目前常用的甲基化抑制剂，通过抑制DNA甲基化转移酶（DNMT）来抑制抑癌基因甲基化从而调节细胞分化和基因表达[3]。本研究应用5-Aza- dC干预培养的人食管癌细胞系KYSE220，观察干预前后CDH13基因启动子区甲基化状态及表达水平，为食管癌药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

KYSE220用含47.5ŒRPMI的1640培养基，加入含5%胎牛血清的47.5% F-12，在37℃，5%CO2的培养液中培养。收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。

1.1.2 试剂和仪器

胎牛血清和RPMI培养基购自GIBCO公司，5-aza-2'-deoxycytidine（Sigma公司），RNA 提取试剂及逆转录试剂盒Transzol（北京全式金公司），基因组DNA 提取试剂（takara），EZ DNA Methylation™ Kit（Zymo research）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含5%胎牛血清的RPMI培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度下孵育培养。将细胞以适宜密度接种，加入含5-Aza-CdR的RPMI培养基，使其药物最终浓度5μmol/L，每24h更换新鲜含药培养基，药物浓度同前，连续作用5d后弃去药液，收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。

1.2.2 DNA提取

用DNAiso Reagent抽提细胞株中高纯度基因组DNA。紫外分光光度计测定核酸吸光度（A）值及DNA浓度。

1.2.3 DNA亚硫酸氢盐修饰

按EZ DNA Methylation™ Kit 说明书进行操作。最后获得10μL TE缓冲液洗脱修饰好的DNA，-20℃保存。

1.2.4 RNA提取、逆转录

按全式金公司说明书用Transzol提取细胞RNA。经凝胶电泳后，使用紫外分光光度仪检测提取的总 RNA 的质量和浓度，要求A260/A280≥2.0，并计算RNA 含量。cDNA的合成反应体系20μL。取Oligo（dT） （0.5 µg /µL） 1μL，每一标本取总RNA 1μg，2×TS Reaction Mix 10μL，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μL，用不含RNAase的水不足至总体积20μL。42℃孵育30 min，85℃加热5min失活TransScript。

1.2.5 引物设计和合成

引物由北京奥克科公司合成。CDH13上游引物：5'-TTCAGCAGA AAGTGTTCCATAT-3' ；下游引物：5'-GTGCATGGACGAACAGAGT-3'。GAPDH 基因上游引物：5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3'；下游引物：5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。

1.2.6 PCR反应条件

95℃预变性5 min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃ 延伸5 min。RT-PCR产物经2%琼脂糖胶分离。

1.3 统计学处理

用药前后比较采用配对t检验。Pearson统计方法分析基因甲基化与其表达之间的相关性，采用SPSS 17.0统计软件包进行处理，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-Aza-Cd作用前后人食管腺癌KYSE220细胞CDH13基因启动子甲基化状态改变

MSP法检测用药前后CDH13基因启动子甲基化状态，干预前KYSE220细胞呈甲基化状态，干预后去甲基化，见图1。

2.2 5-Aza-Cd作用前后人食管腺癌KYSE220细胞CDH13mRNA表达水平

RT-PCR检测用药前后CDH13mRNA水平，干预前KYSE220mRNA水平低下，干预后mRNA水平明显升高，见图2。

3 讨 论

人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，在肿瘤临床确诊之前就可检测出特定基因的异常甲基化，某些基因的甲基化可能使癌症的恶性进展风险增加[4]。CpG岛甲基化导致的抑癌基因失活是可逆转的，利用去甲基化制剂使已经发生甲基化的基因发生去甲基化后可重新表达，恢复抑癌基因功能，可能为临床治疗肿瘤提供新手段。甲基转移酶DNMT催化DNA甲基化，在CpG岛异常甲基化的肿瘤细胞中多呈过表达，该酶已成为DNA去甲基化，恢复抑癌基因功能的靶分子之一[5]。

我们用DNMT抑制剂5-Aza-dC处理食管癌KYSE220细胞后，用RT-PCR方法检测处理前后CDH13mRNA表达水平，结果表明：5-AzadC处理前，KYSE220细胞CDH13启动子区高度甲基化，并呈低表达或表达缺失；经过5-Aza-CdR处理后，CDH13启动子区呈去甲基化，CDH13表达水平明显提高，二者之间有显著相关性，提示在CDH13表达缺失的食管癌癌细胞中，CDH13启动子区甲基化可能导致CDH13表达失活。DNA异常甲基化常出现在肿瘤早期，这为肿瘤早期诊断提供了一定依据。去甲基化制剂5-Aza-dC能有效逆转CDH13基因甲基化状态，激活CDH13基因表达，CDH13基因将可能成为食管癌治疗的一个新靶点；5-Aza-dC有可能用于食管癌的临床治疗，为食管癌患者诊断和治疗提供一个新途径。

[1]Zhong Y.Loss of H-cadherin protein expression in human nonsmall cell lung cancer is associated with tumorigenicity[J].Clin Cancer Res,2001,7(6)： 1683-1687.

[2]Toyooka KO.Loss of expression and aberrant methylation of the CDH13 (H-cadherin) gene in breast and lung carcinomas[J].Cancer Res,2001,61(11)： 4556-4560.

[3]Kantarjian H.Results of a randomized study of 3 schedules of lowdose decitabine in higher-risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia[J].Blood,2007,109(1)： 52-57.

[4]Jin Z.Hypermethylation of the nel-like 1 gene is a common and early event and is associated with poor prognosis in earlystage esophageal adenocarcinoma[J].Oncogene,2007,26(43)：6332-6340.

[5]Ghoshal K,Bai S.DNA methyltransferases as targets for cancer therapy[J].Drugs Today (Barc),2007,43(6)： 395-422.