钛表面贻贝蛋白包被对人真皮成纤维细胞粘附和增殖的影响

王忠山，秦海燕，唐立辉，董岩，卢 帅，杜 静，赵铱民

(1.第四军医大学口腔医学院，陕西西安710032;2.解放军第454医院口腔科，江苏南京210002)

钛因其具有良好的生物相容性、机械性以及耐腐蚀性而被大量用作人体种植体材料。但是钛的物理性能和化学成分都与人体组织相距甚远，不能与骨组织和纤维软组织形成化学键性的结合，特别是种植体经皮段，如果不能与皮肤形成牢固的结合则会造成细菌轻易的入侵以及上皮的下行，最终导致种植体的失败［1］。经皮种植体植入成功并获得持久的稳定性主要依赖于种植体经皮部软组织良好的生物学封闭［2］。大量体外实验证实种植体表面经过不同处理会影响成纤维细胞的粘附、增殖，从而促进生物封闭的形成［3］。

从紫贻贝(Mytilus edulis)提取的贻贝足丝蛋白能够在水环境中粘附到多种基体上，该蛋白具有良好的生物相容性，且无种属特异性［4］。商品化贻贝蛋白试剂BD CELL－TAKTM已成功用于细胞培养、免疫组化、原位杂交技术等方面［5－6］。本研究通过将两种具有细胞粘附作用的贻贝蛋白提取物Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被钛表面后，观察该蛋白对真皮成纤维细胞粘附和增殖的影响，研究其能否用做经皮种植体表面处理。

1 材料和方法

1.1 实验材料和设备

直径15 mm纯钛棒(TA2，西北有色金属研究院);碳化硅砂纸(SAIL BRAND);贻贝足丝蛋白提取物Usun－afix(江苏省江阴贝瑞森生化技术有限公司);BD CELL－TAKTM(BD Biosciences，美国);小儿包皮(第四军医大学西京医院泌尿外科提供);α－MEM培养液、胎牛血清(GIBCO，美国);2.5 g/L胰酶、MTT试剂盒(碧云天，上海);DMSO(Sigma，美国);研磨抛光机(UNIPOL－830，沈阳科晶设备制造有限公司);日立S－4800扫描电镜(HITACHI，日本);KJ－201A 型振荡器(姜堰市康健医疗器具有限公司);Synergy HT酶标仪(BioTek，美国)。

1.2 钛片样本的制备

将直径15 mm的纯钛棒切成厚度1.5 mm的钛片，分别用 240、400、600、800、1 000、1 200、1 500目的碳化硅砂纸在流水冲洗下打磨光滑;依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗30 min，吹干，封装，Co60照射，即为光滑钛片。在超净台内将灭菌后的光滑钛片放置在24孔板内，每孔一片，并分为两组，按产品使用说明，在两组钛片表面分别滴加 Usun－afix、CELL－TAKTM贻贝蛋白，每片 30 μL，涂布均匀后室温静置20 min(乙酸溶剂挥发后蛋白即自动吸附到钛片表面)，无菌去离子水冲洗3次，制成两种贻贝足丝蛋白 Usun－afix、BD CELL－TAKTM包被钛片组，4℃暂存。

1.3 钛片样本表面形貌观察和化学组成分析

随机抽取光滑钛片以及Usun－afix、CELL－TAKTM贻贝蛋白包被钛片各3片，CO2临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察钛片表面的形态;再从上述3组钛片中各随机抽取3片，利用X射线能量色散谱(Energy dispersive X－ray spectroscopy，EDS)分析样品表面存在的元素种类，从而确定贻贝蛋白存在于样本表面。

1.4 人真皮成纤维细胞培养及其在3组钛片样本表面粘附和增殖效果观察

1.4.1 人真皮成纤维细胞原代培养

取小儿包皮术后切除的多余皮肤组织，放入无菌PBS缓冲液中。然后用2.5 g/L的Dispase酶Ⅱ在37℃下处理25 min后，剥除表皮，取真皮用无菌剪刀剪碎，放入含2.5 g/L的胶原酶和2.5 g/L的Dispase酶Ⅱ的溶液中，37℃搅拌2 h，用200目金属滤网过滤，10 mL/L胎牛血清的 PBS洗涤，1 200 r/min离心10 min，弃上清。最后将成纤维细胞以2×104/cm2密度接种到含有100 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L－谷氨酰胺、100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素的α－MEM培养基中，标准环境中培养。24 h内细胞贴壁完成，4 d后细胞长满，常规胰酶消化传代，取第3代的细胞用于实验。

1.4.2 人真皮成纤维细胞在3组钛片样本表面的增殖效果

取光滑钛片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM两种贻贝蛋白包被钛片各12片，分别放入24孔板孔内，每孔一片。取生长良好的P3代真皮成纤维细胞2.5 g/L胰酶消化后，以1×104/孔的密度接种于钛片表面，加入含 100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的α－MEM培养液，标准条件下培养。分别于培养1、3、5 d各时间点时，每组各随机抽取4孔，吸出培养液，PBS洗3次，每孔加入5 mg/mL的MTT液200 μL，培养液800 μL，继续孵育。4 h后，终止培养，吸除上清液，加入600 μL DMSO，震荡10 min，直至在普通光学显微镜下观察发现甲瓒全部溶解(全过程避光进行)后每孔吸取4份150 μL溶解液，转移至96孔板中，酶标仪在490 nm波长下测定吸光度值(OD)，取平均值。同时设不加细胞只加培养液平行孔，用于比色时的吸光度值调零。

1.4.3 人真皮成纤维细胞在3组钛片样本表面的粘附效果

1.4.3.1 DiI－AcLDL 染色荧光显微镜下观察

取1T25瓶P3代真皮成纤维细胞，2.5 g/L胰酶消化，1 200 r/min离心5 min，弃上清。用不含血清的 α－MEM培养基将 DiI－AcLDL稀释至10 μg/mL配制的荧光染液，并以5 mL重悬细胞，37℃避光孵育4 h，去培养液，PBS洗2次，用荧光显微镜观察，看到荧光后确定为标记成功。然后取光滑钛片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM两种贻贝蛋白包被钛片各5片，分别放入24孔板孔内，将已标记成功的成纤维细胞以105/孔的密度接种于各钛片样本表面，在标准环境中继续培养。分别于培养15、30 min和 1、2、4 h后，取各组细胞，吸弃培养液，PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)洗3 次，置荧光显微镜下观察，每组各随机选取1个区域拍摄照片。

1.4.3.2 MTT 法检测粘附效果

取光滑钛片以及 Usun－afix、CELL－TAKTM两种贻贝蛋白包被钛片各15片，分别放入24孔板孔内。取P3代成纤维细胞胰酶消化、计数后，以2×105/孔密度接种于各钛片表面，加入α－MEM培养液(不含血清)标准条件下培养。分别于培养后15、30 min和1、2、4 h各时间点，每组各随机抽取3孔吸弃培养液，PBS洗3次，用MTT法检测剩余贴壁细胞吸光度值，具体方法同1.4.2。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 3种钛片样本表面微形貌观察和化学组成分析

用扫描电镜对3种钛表面进行观察发现抛光钛表面无特殊结构(图1a)。经两种贻贝蛋白包被处理的光滑纯钛表面均形成了一层由贻贝蛋白颗粒密集排列构成的特殊结构，其蛋白颗粒较为均一，粒径约为300～600 nm(图1b、图1c)。

从X射线能量色散谱分析结果可看出，光滑钛片表面主要为Ti、0元素分布(图2a)。经两种蛋白包被后的钛片表面可见N、C、O元素分布(图2b、c)，说明钛片表面有增加的蛋白成分，证实贻贝蛋白已覆盖于纯钛表面。

2.2 真皮成纤维细胞原代培养

成纤维细胞消化培养后4 h开始贴壁，且细胞变长呈梭形，大约24 h贴壁完成，3 d后细胞呈现明显的成纤维细胞特点(图3)。

2.3 人真皮成纤维细胞在3组钛片样本表面的增殖效果

培养1～5 d，成纤维细胞在3种钛片表面的增殖情况类似，两种贻贝蛋白包被组的成纤维细胞增殖效果虽略高于光滑钛片组，但三者之间各时间点均无统计学差异(P＞0.05)(图4)。

2.4 人真皮成纤维细胞在3组钛片样本表面的粘附效果

2.4.1 DiI－AcLDL 染色荧光显微镜观察

荧光显微镜下观察可见，在培养后15、30 min和1 h 各时间点，Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被钛片表面粘附的细胞数目均明显多于光滑钛片表面，而2、4 h时间点时，三者间无明显差异;在1、2、4 h各时间点，Usun－afix和BD CELL－TAKTM包被钛表面的成纤维细胞形态、细胞伸展面积均好于光滑钛片表面，特别是4 h时，Usun－afix和 BD CELL－TAKTM包被钛表面可观察到大量呈现纤维状伸展的细胞，而光滑钛片组细胞伸展效果较差(图5)。

2.4.2 MTT 法检测粘附效果

培养15、30 min 和1、2 h 各时间点，Usun－afix和BD CELL－TAKTM包被钛表面OD值均明显大于光滑钛表面，差异均有统计学意义(P＜0.05);而4 h时三者间均无统计学差异(P＞0.05)。Usun－afix组与BD CELL－TAKTM组相比，各时间点的粘附效果相似，差异均无统计学意义(P＞0.05)(图6)。

图1 3种钛片样本表面微形貌(SEM×50 000)

图2 3种钛片样本表面化学组成分析(EDS)

图3 人真皮成纤维细胞原代培养(倒置显微镜×100)

图4 成纤维细胞在3种不同钛片表面的增值效果比较

图5 DiI染色荧光显微镜观察各组细胞粘附效果

图6 人真皮成纤维细胞在3种钛片表面的粘附效果比较

3 讨论

多巴胺是海洋贻贝粘附蛋白交联过程中的关键成分，将贻贝蛋白溶液在预处理材料的表面进行简单的浸涂即可形成强力附着于矿物质、金属及高分子等多种材料表面的复合层。这是因为多巴胺易被氧化为多巴醌，多巴醌与多巴胺之间能够发生歧化反应并形成自由基，从而交联聚合，或者醌基与多巴胺分子的氨基发生Michael加成反应而形成聚多巴胺［7－8］。本研究所用 Usun－afix和 BD CELL－TAKTM贻贝蛋白能将非贴壁细胞吸附在培养容器的表面，并加速细胞的粘附，且其本身并无细胞毒性［5，9］。

经皮种植体失败的主要原因是上皮下行和细菌感染。目前大多数的研究目的是防止细菌感染，而不是修复周围的皮肤与种植体的结合。本研究提出的思路是希望能促进成纤维细胞在钛片表面早期粘附，尽快形成稳定的生物学封闭，以期尽量减弱种植体植入早期的上皮下行和细菌侵袭，进而提高经皮种植体植入的成功率［10］。成纤维细胞在光滑钛表面、Usun－afix和BD CELL－TAKTM两种贻贝蛋白包被的钛片表面的增殖和粘附结果显示:贻贝蛋白包被的钛片表面能促进人真皮成纤维细胞在其表面的粘附并促进了细胞骨架的伸展，且时间点越早，促粘附的效果越好，但长期(5 d)观察未发现明显的促增殖效果。通过检测活细胞的代谢活性能确定细胞的数量，细胞代谢活性的高低与其粘附在基底表面的细胞数呈线性相关关系。在细胞粘附实验中，考虑到细胞膜上的糖蛋白与贻贝蛋白粘结位点结合，可以迅速稳定地粘附到钛表面，而血清会使这些结合位点封闭，不利于细胞的粘附，故采用不含血清的培养基。MTT检测结果显示:在培养15、30 min 和1、2 h 各时间点，Usun－afix和BD CELL－TAKTM两种贻贝蛋白包被表面均明显促进成纤维细胞的粘附，说明贻贝蛋白在成纤维细胞贴壁的早期可发挥显著作用，从而促进了细胞在材料表面的粘附，为以后形成良好的软组织生物封闭奠定了基础，进而有望进一步提高种植体的成功率。在4 h时间点，MTT检测和DiI染色荧光显微镜下观察，细胞结合数量均无明显的差异，推测原因是在此时间点细胞在3种材料表面大部分均已完成了贴壁过程，从而没有呈现明显的统计学差异。细胞增殖实验也印证了这一观点，1、3、5 d成纤维细胞在3种材料表面的增殖无明显差异。

经皮种植体植入成功并获得持久的稳定性依赖于种植体经皮部软组织良好的生物学封闭［11］。本结果证实贻贝蛋白包被钛片表面能够明显促进人真皮成纤维细胞早期粘附，从而促进手术部位周围结缔组织的生长，但能否应用于临床还有待进一步的研究。海洋贻贝粘附蛋白强度高，生物安全性好，能在水中发挥作用，而且这种天然蛋白质不会带来环境污染，具有很大的应用价值［11－12］。但目前对贻贝足丝蛋白的研究还很少，而且贻贝蛋白提取物产量低、价格昂贵使其具有一定的局限性［13］。通过基因工程合成贻贝蛋白是一种可行的技术［14－15］，有望带来巨大地经济和社会效益。

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