bFGF对人根尖牙乳头干细胞成脂分化影响的研究

吴家媛，贾 谦，何文喜，李玉成，况 蓉，倪龙兴，牛忠英

(1.第四军医大学口腔医学院，陕西西安710032;2.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义563003;3.北京解放军第306医院，北京100101)

根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)是存在于年轻恒牙根端组织中的具有比牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)更强的群体倍增能力、端粒酶活性、迁移率及成牙本质能力的一类间充质干细胞［1－2］。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对间充质干细胞(MSCs)具有诱导细胞趋化、促有丝分裂等作用，在MSCs早期分化和发育进程中发挥着重要的作用［3］。本课题组前期实验结果显示，bFGF在一定的浓度范围内能抑制SCAP的成骨分化，增加细胞的STRO－1、Nanog、Sox2、Oct4 Rex1的表达，从而推测bFGF可维持SCAP的干性(Stemness)［4］。多向分化能力是干细胞生物特性之一，其能力的强弱在某种程度上提示干细胞多分化潜能的强弱。bFGF是否在成脂分化中也发挥着同样的作用，尚未见文献报道。而且关于bFGF对MSCs成脂分化的作用，相关研究结果也并不一致［5－7］。故本研究以体外培养的SCAP为对象，初步探讨bFGF对SCAP成脂分化能力的影响，以期明确bFGF是否也能在成脂分化方向上维持SCAP的干性(Stemness)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

高糖DMEM培养基 (Gibco，美国);胎牛血清(Hyclone，美国);谷氨酰胺、胰岛素、维生素C、DMSO 油红 O、BrdU(sigma，美国);IBMX、MTT(A-lexis，美国);吲哚美辛(武汉远成药业);相差显微镜(Leica DM 6000B)，Mastercycler PCR 仪(Eppendorf，德国);Ps250电泳仪(Savant，美国);BIO－RAD Gel－Doc 2000凝胶成像系统;分光光度计(eppendorf，德国)。

1.2 方法

1.2.1 根尖牙乳头干细胞(SCAP)的分离、培养及鉴定

收集16～22岁志愿者因正畸需要新鲜拔除的未发育完全的健康第三磨牙，立即用含双抗(100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)的 PBS液反复清洗，分离根尖牙乳头并剪碎后加入3 mg/mL的Ⅰ型胶原和4 mg/mL Dispase酶，37℃下轻轻震荡消化1 h，PBS液洗两遍后接种于6孔培养板，加入含 150 mL/L FBS的 α－MEM 培养基 (含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)，置 50 mL/L二氧化碳孵箱中37℃培养，2～3 d换液1次。待细胞生长汇合至80%时，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集细胞，参照文献［4］进行初步鉴定，并以有限稀释法筛选克隆化生长的细胞，按1∶3比例进行传代培养。

1.2.2 bFGF对SCAP成脂分化能力的影响

取生长状态良好的第3代SCAP以2×104细胞密度接种于60 mm培养皿中，加入含150 mL/L FBS的α－MEM培养基进行培养。待细胞达到80%融合时，弃原液并随机分为2组，实验组加入2 mL含bFGF终末浓度为5 ng/mL的成脂诱导液(含100 mL/L FBS、0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌吟、0.5 mol/L氢化可的松、60 mol/L吲哚美辛的α－MEM);对照组加入相同体积不含bFGF的成脂诱导液继续培养，3 d换液。诱导培养3周后在倒置显微镜下观察细胞形态的变化以及脂肪滴形成情况;油红O染色，相差显微镜下观察并拍照。

1.2.3 RT－PCR 检测脂肪细胞标记基因 PPAR－γ2

取生长状态良好的第3代SCAP，按1.2.2方法分为实验组和对照组，分别在含或不含bFGF(5 ng/mL)的成脂诱导液中进行诱导培养，每3 d换液1次。分别于培养1周和3周，用RNAiso核酸提取试剂盒提取各组细胞的总 RNA;取2 μg总RNA逆转录合成cDNA。参照文献［8］设计引物并由北京华大基因公司合成，引物序列分别为PPAR－γ2:5’－CAT TCT GGC CCA CCA ACT T－3’(上游)和 5’－CCT TGC ATC CTT CAC AAG CA－3’(下游);GAPDH:5’－GTC AAG GCC GAG AAT GGG AA－3’(上游)和 5’－GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG－3’(下游)。取 2 μL CDNA 在 20 μL总反应体系中进行RT－PCR扩增，反应条件:94℃30 s，65 ℃延长1.5 min，循环30 次，72 ℃延伸10 min结束反应。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，于凝胶成像系统上照相并进行灰度值分析。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间比较用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 SCAP 原代培养

人第三磨牙根尖牙乳头呈粉红色，硬度中等，易从根尖孔剥离(图1a)。酶消化法原代培养3 d即可观察到细胞贴壁生长，贴壁细胞伸展后呈成纤维细胞样，体积较小，胞体丰满，胞核位于中央，形态较均一;少数可见方形、椭圆形和多角形，细胞呈巢状或集落状生长(图1b、c)。

2.2 bFGF对SCAP成脂分化能力的影响

经成脂诱导3周后，镜下可见对照组的细胞密度少于实验组(bFGF组)，细胞拉长呈条状生长，体积变大，细胞胞浆内及胞外可见圆形折光性脂滴形成;实验组的细胞体积小，胞浆立体，细胞呈梭形，方形或多角形，细胞线行排列，细胞有圆形折光性脂滴形成(图2a、b)。油红O染色观察，两组均可见脂滴形成，其中实验组脂滴染色面积较多，胞内外均可见脂滴形成，且有部分脂滴融合。对照组细胞体积较大，虽胞内外均有大量脂滴形成，但数量少于实验组(图2c、d)。

图1 SCAP的原代培养

图2 成脂诱导3周细胞形态及油红O染色观察

图3 RT－PCR检测PPAR－γ2 mRNA表达

2.3 RT－PCR 检测PPAR－γ2 mRNA 表达情况

SCAP成脂诱导培养1周时，实验组(bFGF组)PPAR－γ2 mRNA表达低于对照组，但二者间无统计学差异(P＞0.05);诱导3周时，实验组中的PPAR－γ2 mRNA表达量明显高于对照组，两组间灰度值比较差异有统计学意义(P＜0.05)(图3)。

3 讨论

多向分化和自我更新是干细胞干性的特征性表现，研究表明BMSC向成骨和成脂分化通常维持在一个平衡水平，一旦成骨分化较多，则成脂分化就会相应减少［9］。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator－ activated receptor－ γ2，PPAR－γ2)基因是脂肪细胞分化标志性基因［10］。PPAR－γ2过表达时能促使成纤维细胞系的成脂转化，而PPAR－γ2缺陷鼠的胚胎干细胞及胚胎成纤维细胞则无成脂分化能力。故通过检测PPAR－γ2的表达可间接反映细胞的成脂分化能力。本实验中在成脂诱导3周后，实验组SCAP中的脂滴形成数量多于对照组，而且细胞密度相对较大，细胞体积小，未见拉长及变大等现象。RT－PCR检测PPAR－γ2基因表达水平发现，诱导培养1周时，2组基因表达无显著性差异;3周时实验组PPAR－γ2基因表达明显高于对照组。表明bFGF长时间作用于SCAP并进行成脂诱导时能使其维持特异性基因的表达，提示bFGF具有提高SCAP成脂分化的潜能。

研究报道，bFGF对4、6、9代人骨髓MSC成脂诱导无影响，bFGF组的PPAR－γ2基因表达直到9代仍保持与未添加bFGF类似的水平［11］。但以上实验中未对PPAR－γ2基因的表达做定量分析，其所得结论尚有待进一步证实。而Neubauer等［12］在鼠MSC中研究则发现，bFGF可在鼠MSC分化的各个阶段提高其成脂分化的能力和PPAR－γ2的表达。周媛等［5］也发现，bFGF能促进人MSCs向脂肪分化过程中PPAR－γ2的表达。本研究发现，在成脂诱导中，添加5 ng/mL bFGF组(实验组)的细胞数量一直在显著增加，而且细胞依旧保持类似纺锤型，体积小而立体;而对照组中的细胞则有拉长、变大等现象，推测可能是由于诱导培养过程中bFGF作用于SCAP时能维持其干细胞基因的表达，某种程度上抑制了细胞的老化，进而抑制细胞功能的衰退，故在bFGF存在的情况下对SCAP进行长时间成脂诱导时可促进其PPAR－γ2 mRNA的表达。Colleoni等［13］也提出了相同的观点，在其研究中发现，bFGF可抑制脂肪干细胞在诱导分化中发生衰老和形态改变，提示细胞在体外长时间培养时，bFGF可通过抑制细胞老化而维持其分化潜能。Amit等［14］发现，bFGF刺激 hESCs能持续其增殖，却不促进其分化，但在含有bFGF和血清培养基中生长的hESCs相对小而密，形态更典型。

本研究结果表明，诱导早期bFGF对SCAP的成脂能力无影响，随着诱导时间的延长，bFGF可促进PPAR－γ2的表达，提示其具有促进SCAP成脂分化的潜能。

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