坛紫菜赤腐病与拟油壶菌病并发病的初步研究

刘一萌，马家海，文茜

(上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室，上海201306)

坛紫菜Porphyra haitanensis和条斑紫菜Porphyra yezoensis是中国主要的紫菜栽培种。坛紫菜主要产于中国福建省、浙江省、广东省，是中国特有的暖温带性经济海藻［1-2］。根据农业部渔业局公布的数据［3］，2010年坛紫菜产量 (浙、闽、粤三省)、条斑紫菜产量 (苏、鲁二省)分别为82 767、24 468 t。坛紫菜产量是条斑紫菜产量的3倍多，是中国产量最高的紫菜栽培种。近年来，随着紫菜栽培面积的不断扩大，海区环境不断恶化，以及管理上出现的种种问题，导致紫菜病害时有发生，2005、2008、2010年度福建省坛紫菜病烂率分别为26.7%、20%、28%，而2008年度内，福建省福鼎市坛紫菜病烂率高达80%［4-7］，给紫菜生产企业带来了巨大损失。目前，国内对于紫菜的病害研究多见于条斑紫菜，而对坛紫菜的病害研究则远远落后于条斑紫菜。研究报道的条斑紫菜病害主要有赤腐病［8］、拟油壶菌病［9］、丝状细菌附着症［10］等，而关于坛紫菜病害的研究，多为对紫菜病害的预防以及发病后的对策，仅对红烂病的研究较为深入［11-12］。对坛紫菜赤腐病的报道仅仅是观察到紫菜腐霉菌丝的存在［13］，对该病害的研究还不透彻，对坛紫菜拟油壶菌病的研究国内几乎是空白。Ding等［14］曾研究过条斑紫菜上赤腐病与壶状菌病并发病，而对坛紫菜并发病的研究目前尚未见报道。为此，作者对坛紫菜赤腐病和拟油壶菌病并发病过程进行研究，旨在探明坛紫菜上紫菜腐霉Pythium porphyrae以及拟油壶菌Olpidiopsis sp.的生活史，并为建立防治该病的体系及技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究课题组分别于2009年11月至2010年2月、2010年9月至2011年2月和2011年8月至2012年2月，对福建省晋江市、福鼎市、霞浦县以及浙江省苍南等坛紫菜栽培海区环境条件以及坛紫菜栽培的发病状况进行调查。

试验用坛紫菜采自上述调查海区，坛紫菜样品经阴干，在0～4℃低温下12 h内带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 样品的挑选与处理 挑取部分患有病烂的坛紫菜叶状体，利用过滤消毒海水清洗紫菜叶状体，并用消毒毛笔反复洗刷叶片表面，清除附着物。将清洗过的坛紫菜叶状体置于过滤后密度为1.020 kg/m3的消毒海水中，加入2%(体积分数，下同)PES营养液，进行充气培养，每隔3～4 d加入2%的PES培养液，每隔7 d换水1次。培养条件:温度为20℃，光照强度为48.07～64.1 μmol/(m2·s)，光周期为10L∶14D。将剩余病烂的坛紫菜样品经消毒海水清洗，阴干至含水量为20%～30%后，置于-20～-18℃冰箱中保存。挑取正常坛紫菜叶状体置于上述相同培养条件下进行培养，以供对照。

1.2.2 切片的制备与观察 将培养的病烂坛紫菜和冰箱中保存的病烂坛紫菜用海水复苏培养后，切取该叶片的病烂部位，并制作成临时装片，利用显微镜Olympus Bh41和相机MicroPublisher 5.0 RTV对病症特征进行观察和记录。利用Leica CM1900冷冻切片机对患病部位进行横切，制作成切片进行观察。正常坛紫菜的切片制备与观察同病烂坛紫菜。

2 结果

2.1 病害发病分布特征

采集到的患有病烂的坛紫菜，多为近海栽培密集的坛紫菜，特别是在内湾栽培的紫菜，而河口附近的栽培海区，病烂最为严重 (图1-A)，大多数网帘上出现了空网现象。同一张网帘上，中心病烂程度大于周边;而在同一内湾，湾口紫菜病烂少;远海海区的坛紫菜病烂较少 (图1-B)。

图1 网帘上的坛紫菜Fig.1 The laver Porphyra haitanensis on nori nets

2.2 患病紫菜的症状

患有病烂的坛紫菜有不同程度的病斑、病烂，肉眼观察病斑多为圆形，颜色为绿色或黄绿色，接着这些病斑便会溃烂成孔洞，部分藻体上有时可见到红色水泡 (图2-A)。发病严重时，病斑大片连接，形成较大的孔洞，加上风浪作用，紫菜随即脱落，造成损失。而海区栽培的坛紫菜，有部分患病紫菜叶状体病斑在刚转为绿色、黄绿色，并没有形成孔洞时，便会因风浪的作用而破碎，致使紫菜减产。经观察，病斑在藻体梢部、中部和基部都有发生，藻体梢部边缘较为严重 (图2-B)，而病斑出现在基部时会使紫菜整体脱落，造成坛紫菜大幅减产。

图2 患有赤腐病和拟油壶菌病的坛紫菜Fig.2 Simultaneous infection by red rot and olpidiopsdisease in the laver Porphyra haitanensis

2.3 紫菜腐霉菌侵染坛紫菜的过程

紫菜腐霉游动孢子呈肾脏状，具有两根等长的鞭毛，各向前、后伸出 (图3-A)。游动孢子释放后，遇到紫菜叶片，便会附着在叶片表面，并很快会伸出萌发管侵染紫菜细胞 (图3-B)，镜检显示，与正常坛紫菜细胞 (图3-C)相比，被腐霉菌感染的坛紫菜细胞有菌丝体穿透现象 (图3-D)，一条菌丝体可贯穿多个紫菜细胞，呈链珠状;各条菌丝纵横交错生长，密布成网，此为紫菜赤腐病的显著特点。被穿透的紫菜细胞萎缩死亡，死亡细胞呈深红色，不久，死亡细胞腐烂，藻红素溶出，聚集在病斑处，形成红泡。发病严重时，可见到同一个紫菜细胞同时被多根菌丝穿透 (图3-E)，部分菌丝甚至可伸出叶片外 (图3-F)。腐烂后的细胞为绿色、黄绿色，最后病斑破裂，形成孔洞。腐霉菌丝侵染坛紫菜5～7 d后，部分菌丝上会形成一球囊结构，即孢子囊，内含淡青色颗粒为游动孢子 (图3-G)，此为腐霉菌丝的无性生殖器。在一定条件下，部分腐霉菌丝上可形成一膨大球状有性生殖器，内含一个卵孢子，此为藏卵器(图3-H)，外有一半球状结构，为藏精器。

2.4 拟油壶菌侵染坛紫菜的过程

镜检发现在患有赤腐病的藻体病斑上，部分紫菜细胞膨大，呈椭圆体或球形，内有明亮的油滴，一端有浓绿色突起，此为拟油壶菌病的典型症状。

拟油壶菌游动孢子大小为2.0～3.5 μm(图4-A)，为白色或淡青色，具有长短不同的两根鞭毛，游动孢子释放在水体里遇到坛紫菜叶片，便会附着在其表面，并感染健康的坛紫菜细胞 (图4-B)。在拟油壶菌发病初期，可在被感染的坛紫菜细胞中观察到有外膜包被的球形透明菌体，内含数个明亮的油滴 (图4-C)，与正常坛紫菜细胞液泡有明显区别。随后，菌体不断生长膨大，将坛紫菜细胞内容物逐渐挤压到细胞一端，形成浓绿色突起 (图4-D)。严重时，部分坛紫菜细胞内可观察到寄生了2个甚至更多菌体的现象 (图4-E、F)，该菌体亦可侵入坛紫菜精细胞内 (图4-G)。侵入坛紫菜细胞的菌体逐渐成熟，形成孢子囊，内含游动孢子 (图4-H)，但在精细胞内未发现有孢子囊形成。孢子囊成熟后，便向细胞外伸出排放管，并通过排放管释放出游动孢子 (图4-I、J)。孢子释放后，仅残留孢子囊壁以及破碎的紫菜细胞壁(图4-K)，不久该部位破裂形成孔洞 (图4-L)。

3 讨论

本研究中，在采集到的患病坛紫菜上，由菌丝穿透紫菜细胞，致使紫菜细胞萎缩死亡，并通过孢子囊进行无性生殖，产生游动孢子感染其他健康紫菜细胞，并在一定条件下菌丝上形成藏卵器、藏精器等有性生殖器结构，与条斑紫菜赤腐病症状相符，可确定该菌丝为腐霉菌丝，由其引发的病害为赤腐病 (red rot disease)。条斑紫菜赤腐病是由紫菜腐霉 Pythium porphyrae寄生引起的，新崎盛敏［15］最先研究该菌属于腐霉菌科的腐霉属Pythilum，Takahashi［16］将其定名为 Pythilum porphyrae，之后先后有学者对该病进行了深入研究，Fujita等［17］、Uppalapati等［18］认为，可以通过菌丝、藏卵器、藏精器等形态特征以及寄生对象确定寄生菌是否为紫菜腐霉菌，紫菜腐霉菌Pythium porphyrae在分类学上的分类阶元为卵菌门Oomycota、卵菌纲Oomycetes、霜霉目Peronosporates、腐霉科Pythiaceae、腐霉属 Pythium［16，19-20］。紫菜拟油壶菌病(olpidiops disease)最早被发现在条斑紫菜上，报道指出，仅能依靠形态学特征确定此菌［20］，其显著特征为:菌体内含有油亮颗粒，在生长过程中不断增大，将紫菜细胞内含物推挤到一侧，形成浓绿色突起，并在寄主细胞内形成孢子囊进行无性繁殖，以及孢子囊伸出排放管释放游动孢子。该病原菌侵染细胞后形成一“壶状”结构，因此，在国内该病一直以来被命名为“壶菌病”(或“壶状菌病”)，易与壶菌Chytridium sp.相混淆，壶菌在分类上属于壶菌纲Chytridiomycetes、壶菌目Chytridialas。周与良等［21］经过研究，将拟油壶菌属分类于卵菌纲Oomycotes、链壶菌目Lagenidiales。李宇航等［10］将该病命名为“拟油壶菌病”。

在同一片患病坛紫菜叶片上，可观察到存在赤腐病病斑的同时，还存在拟油壶菌病，是赤腐病和拟油壶菌病的并发病 (图3-B)。太田扶桑男曾指出，在条斑紫菜上拟油壶菌病的发生往往会与其他病害一同发生，导致紫菜产量下降［22］。

两种病害导致的病烂在坛紫菜幼叶以及成熟叶状体上都有发生，并且各自进行感染，加大了病烂程度，同时也加快了紫菜脱落流失速度，给紫菜生产带来巨大危害。赤腐病及拟油壶菌病同为寄生性微生物引起的传染性病害，目前，两种病害还没有有效的治疗手段。但可在病害出现早期，及时采收紫菜，能够有效地减少病害造成的损失。低盐度利于腐霉菌丝的生长［8，22］，为赤腐病发生提供了条件;而坛紫菜拟油壶菌病发病之前，有时可见到细胞内容物异常，如细胞内出现液泡，这或许是拟油壶菌感染紫菜的条件之一，液泡的出现与海水比重降低有一定的关系，这与种植在河口附近的紫菜患病率高的调查结果相一致，因此，低盐度是引发两种病害同时爆发的诱因之一。腐霉菌丝宜于生长在较高水温环境下，特别是在天气突然升温，并且高温持续一定时间的情况下，宜于爆发赤腐病。

赤腐病以及拟油壶菌病多在水体交换差的海区内爆发，而本次调查的坛紫菜栽培海区大多都集中在近海，特别是内湾。内湾水流不畅，营养盐补给、水温调节以及气体交换差，为两种病害同时爆发创造了有利条件，海区紫菜栽培密度过大，栽培筏架设置密度过高，加剧了海水交换不畅，更易引发两种病害的发生;远海以及湾口紫菜病害发病较少，原因可能是，两种病害都是通过游动孢子进行传染，而远海和湾口水流畅通，栽培密度小，水体交换速度快，紫菜腐霉以及拟油壶菌游动孢子不易附着于紫菜叶片上，很难侵染紫菜，有利于坛紫菜健康生长，这与海区调查结果相一致。因此，合理布局对于预防病害发生和减缓病害程度都有着积极意义［23］。对于已经发生病害的网帘，要及时撤下来，以免扩大传染。日本資源協会认为，在条斑紫菜赤腐病的防治上，用有机酸等药物处理患病紫菜，可杀死紫菜腐霉菌丝［24］;一些物理手段也可以有效减缓两种病害发生带来的危害，紫菜腐霉菌丝和拟油壶菌的游孢子对于干燥的忍受力很差，在发病初期增加叶状体干出时间，如调高网帘高度，延长干出时间，可抑制赤腐菌丝和拟油壶菌菌体的生长，一定程度上减缓两病的蔓延。但是由于拟油壶菌是寄生在紫菜细胞内部，干出并不能很有效地杀死菌体，只能减少拟油壶菌的传染。低温可以同时抑制腐霉菌丝和拟油壶菌菌体的生长，因此，利用冷藏网技术，也可减缓两种病害的蔓延。如遇到连日降雨的天气或其他利于病害发生的条件时，可将附有紫菜的网帘从海区撤下来，及时阴干，存于冷库中，待度过雨水天气后，再将网帘挂出来，以规避病害爆发期。

图3 紫菜腐霉菌侵染坛紫菜的过程Fig.3 Development process of Pythium porphyrae on Porphyra haitanensis

图4 拟油壶菌侵染坛紫菜的过程Fig.4 Development process of Olpidiopsis sp.on Porphyra haitanensis

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