草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白的表达与纯化

方珍珍，景宏丽，江育林，张利峰，张旻，李华

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023;2.天津农学院水产科学系，天津300384;3.中国检验检疫科学研究院，北京100029;4.北京出入境检验检疫局，北京100026)

草鱼出血病是一种具高度传染性和致死性的病毒性鱼病，该病流行于中国各地草鱼养殖区，尤以长江流域和广东、广西、福建最为普遍，死亡率高达80%，严重影响了草鱼Ctenopharyngodon idellus养殖业的发展。1972年首次报道该病，1978年确定为病毒病，1980年首次在病鱼的头肾切片中观察到呈晶格状排列的病毒粒子，1984年确定草鱼出血病病原为呼肠孤病毒［1-2］。草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)是中国分离、鉴定的第一株水生动物病毒，对该病毒的形态学、生物学、流行病学、理化及分子生物学等方面已进行了系统的研究［3-8］。

草鱼呼肠孤病毒的基因组由11个dsRNA片段组成，不同的毒株间病毒基因组的总分子质量差异不大 (相对分子质量约15×106)，但各片段分子质量有所差异。近年来，方勤等［9］通过序列分析和三维结构研究表明，成熟的GCRV颗粒由7种结构蛋白和4种非结构蛋白组成，其中病毒蛋白VP5和VP7构成了病毒的外层衣壳组分。通过蛋白酶裂解试验揭示了VP5和VP7在病毒感染及致病中起着不可替代的作用。此外，VP5还可进行构象的改变，其作用是保证膜穿透［10-12］，同时VP5也是GCRV的衣壳蛋白，可能具有较高的免疫原性。

关于草鱼出血病的检测，电镜观察是最直观而有效的方法，在最初的研究中应用较多，但是存在着技术和仪器要求以及样品制备复杂等问题［13］。分子检测技术PCR方法虽然具有高灵敏度的优点，但由于存在假阳性，在结果判定上容易出现不确定性，并且难以判断是具有完整病毒粒子还是仅存在残余的病毒核酸［14-16］。因此，用于抗原检测的免疫学方法可以作为确诊的重要依据。而免疫学方法的应用需要一定量的抗血清，通常采用灭活毒株免疫动物获得免疫血清，但这种方法需要增殖大量的病毒并对其纯化，血清生产成本高，过程复杂，制约了抗血清的大量获得。本研究中，作者在对GCRV基因序列分析的基础上，选择病毒的外壳蛋白VP5基因进行表达载体的构建和蛋白表达，以期得到人工表达的病毒外壳蛋白，旨在为该病毒单克隆抗体和多克隆抗体的制备，以及免疫检测试剂盒的研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株和载体 毒株GCRV-873为中科院武汉病毒所赠送;pET-30α质粒购自Novagen公司;大肠杆菌E.coli DH5α、大肠杆菌BL-21(DE3)、RNA提取试剂盒 (硅基质膜吸附法)、Quant一步法RT-PCR试剂盒 (高效逆转录酶)、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自天根生化科技 (北京)有限公司;限制性内切酶SacⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶均购自NEB公司;蛋白预染Marker购自 Fermentas公司;Ni-NTA HisBind融合蛋白纯化购自MERCK公司。

1.1.2 引物 根据GenBank中的序列(登录号AF239175)设计引物GCRV-U和GCRV-D分别为5'GAGCTCGGACTTCGCACTCTCTCTACAATG3'，5'CTCGAG AA GTTCACGCGGGCATGGAAG 3'。上游引物引入SacⅠ位点，下游引物引入XhoⅠ位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GCRV-873病毒总RNA的提取和RTPCR扩增 使用RNA提取试剂盒提取总RNA。取总RNA 10 μL配制50 μL反应体系，进行 RTPCR扩增。反应条件:先在50℃下反转录30 min，再于94℃下预变性2 min;然后在94℃下变性1 min，在60℃下退火1 min，在72℃下延伸2 min，共进行35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

1.2.2 PCR产物的亚克隆 取PCR回收产物用SacⅠ和XhoⅠ双酶切，用10 g/L琼脂糖凝胶回收目的片段;pET-30α质粒同样用SacⅠ和XhoⅠ双酶切、回收。取经酶切处理的1 μL pET-30α质粒、5 μL GCRV-VP5基因 PCR 产物、1 μL T4 DNA连接酶和1 μL 10×连接酶buffer，在16℃下连接12 h，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌落克隆，阳性菌落经过PCR和双酶切鉴定后，送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

1.2.3 重组大肠杆菌的诱导培养和目的蛋白的检测 挑取测序验证构建成功的pET-30α重组质粒和空质粒分别转化至大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素 (Kan)的固体LB平板上，于37℃温箱中培养过夜。分别挑取带有重组质粒和空质粒的单克隆菌落接种于3 mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃下摇床培养过夜。次日转接种至50 mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃下摇床培养至光密度值OD600nm=0.6。每个克隆选取一瓶，加入原始浓度为1 mol/L的IPTG培养液，至终浓度为1 mmol/L，并于37℃下诱导培养4 h，分别离心收集菌体并超声破碎，将离心后的上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，凝胶用考马斯亮蓝染色。

1.2.4 包涵体的粗提和洗涤 取1 L菌液，参照《分子克隆实验指南》［17］有关方法，以低速离心收集沉淀，将沉淀重悬于细胞裂解液 (50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中，用功率为400 W的超声按照作用3 s、间隔3 s进行处理，直至菌液澄清。以4 000 g离心15 min，弃上清，收集沉淀，除去大部分可溶菌体蛋白。将沉淀于含有Triton-100的细胞裂解液中洗涤2～3次，进一步去除杂蛋白和杂质。最后收集沉淀，于-20℃下保存。

1.2.5 融合蛋白的纯化 将洗涤后的包涵体用含8 mol/L尿素的PBS缓冲液完全溶解，经带有Ni-NTA HisBind的树脂混匀，用柱层析纯化融合目的蛋白，用含4 mol/L尿素的透析液 (0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0)进行透析，然后逐步降低尿素浓度至零，透析48～60 h后，取10 μL进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 Western blotting分析 取纯化后的融合蛋白样品，经SDS-PAGE电泳后，用湿法电转移至硝酸纤维素膜中，以质量分数为10%的脱脂奶粉封闭过夜。次日进行Western blotting试验，分别以His·Tag单克隆抗体和羊抗GCRV抗血清作为一抗，于37℃下孵育1 h，用1×PBST洗涤3次。加入用HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠二抗和抗羊二抗，于37℃下孵育1 h，再用1×PBST洗涤3次，加入DAB显色，用去离子水终止反应。

1.2.7 多克隆抗体的制备及抗体效价的检测 将纯化病毒和表达蛋白分别作为抗原免疫山羊，共免疫4次。第一次基础免疫:抗原与弗氏完全佐剂按1∶1混合，皮下多点注射，免疫剂量为1 mg/只。一周后加强免疫一次:抗原与弗氏不完全佐剂按1∶1混合，皮下注射，免疫剂量为1 mg/只。之后每隔一周加强免疫一次，注射剂量加倍。4次免疫后采血，分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价。

2 结果

2.1 重组克隆的鉴定

从细胞培养的GCRV-873病毒悬液提取总RNA，通过RT-PCR扩增GCRV-VP5基因，得到约为2 005 bp的PCR产物 (图1)。PCR产物克隆至pET-30α质粒，转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中，挑取过夜生长的菌落，进行小量培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用SacⅠ和XhoⅠ做酶切鉴定，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，可得到2 005 bp的DNA目的条带 (图2)，并鉴定为阳性重组质粒，命名为pET-30α-GCRV-VP5。菌落经PCR鉴定为阳性，显示克隆成功。

图1 GCRV-873病毒VP5基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of GCRV-873 strain VP5 gene

图2 重组质粒pET-30α-GCRV-VP5的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombination plasmid pET-30α-GCRV-VP5 by enzyme digestion

测序结果显示，该基因序列与GenBank公布的AF239175相似性达99%，提示已成功构建了重组质粒pET-30α-GCRV-VP5。

2.2 表达产物的可溶性分析

诱导表达后，细胞经超声处理，上清与沉淀分别进行SDS-PAGE。结果显示，目的蛋白大部分在超声后的沉淀中，提示表达产物主要以不可溶的包涵体形式存在(图3(a))。

2.3 融合蛋白的纯化

将包涵体用Ni-NTA HisBind树脂将目的蛋白纯化，透析后进行SDS-PAGE分析。结果显示，可得到纯度较高的蛋白，经测定其质量浓度约为0.5 mg/mL(图3(b))。

2.4 重组蛋白的Western blotting鉴定

对纯化后重组蛋白进行Western blotting检测，结果显示，以His·Tag单克隆抗体为抗体，在硝酸纤维素膜相对分子质量为77 000处出现一特异性反应条带(图4(a))，同时以羊抗GCRV抗血清为抗体，也可出现相同分子质量大小的特异性反应条带(图4(b))，证实了相对分子质量为77 000处的条带为含有目的蛋白的融合表达产物。

2.5 多克隆抗体的效价

分别用病毒和表达蛋白作为抗原，对免疫山羊4次后获得的抗血清，用ELISA法测得抗体的效价均在10-4。表明两种抗原均可诱导动物产生良好的体液免疫反应。

3 讨论

本研究中对GCRV-VP5基因进行了人工表达，用表达的重组蛋白作为抗原，免疫动物并使之产生相应的抗体，表达的需要量较大，为此构建了原核表达体系。将RT-PCR扩增出的目的条带连接到表达质粒pET-30α中，构建的重组质粒转化至大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞中进行表达。经过SDS-PAGE分析，诱导后重组菌在相对分子质量约为77 000处出现一条蛋白条带，提示感受态菌可能表达了含有目的蛋白的融合表达产物。经Western blotting鉴定，该条带可以与His·Tag抗体和羊抗GCRV抗血清特异性结合，表明在相对分子质量为77 000处的条带的抗原性和病毒蛋白的抗原性相似，也表明其中含有目的蛋白的融合表达产物。而利用pET-30α质粒载体系统表达的外源基因，表达蛋白带有6个组氨酸标记，因6×His很小，所以不会影响表达蛋白的结构和功能，无需用蛋白酶把6×His切除［18］。而且6×His免疫原性差，融合蛋白可直接用作抗原产生所需的抗体。

图3 重组蛋白的表达和包涵体的洗涤及重组蛋白的纯化Fig.3 Expression of recombinant proteins and washing，and purification of recombinant proteins

图4 重组蛋白与His·Tag单克隆抗体、羊抗GCRV抗血清进行免疫印迹Fig.4 Western blot analysis by recombinant proteins with His·Tag monoclonal antibodies，and goat anti-GCRV serum

本研究中在37℃下诱导，对表达产物的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，结果表明，该融合产物主要以包涵体的形式存在。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，是包涵体形成的原因之一［19］。但蛋白以包涵体形式出现，其蛋白的自然结构和抗原活性都会受到很大影响，为此进行了包涵体的洗涤、溶解、纯化、复性。本试验中首先通过物理方法超声破碎对表达菌进行裂解。由于菌体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白常常与包涵体粘连在一起，因此在溶解包涵体之前的洗涤非常重要。本研究中参照《分子克隆实验指南》［17］对包涵体进行了洗涤，取得了较好的洗涤效果。对包涵体进行溶解纯化后，如何将其转化成有活性的蛋白，其中蛋白质的复性是非常重要的一步。在实验室中，一般采用传统的稀释和透析方法进行复性。由于多肽链之间的聚集容易造成蛋白质沉淀，而蛋白质的浓度是引起多肽链聚集的主要因素。通常蛋白质的质量浓度控制在0.1～1.0 mg/mL。变性蛋白经过尿素处理至可溶以后，再逐渐滴加到复性液中使之复性。但如果加到复性液中的速度过快，就容易形成絮状沉淀，这可能是蛋白重新凝聚的缘故［20］。为此，Mayer等［21］设计了一种缓慢透析法，用8 mol/L的尿素溶液作为起始透析液，然后逐渐稀释降低透析外液的尿素浓度。变性剂浓度连续缓慢下降，有助于减少蛋白质复性过程中沉淀的出现，提高活性蛋白质的收率。因此，本研究中选择透析复性，蛋白质质量浓度为0.5 mg/mL，复性后离心仅有少量沉淀，复性效果较好。

本试验中制备的两种多克隆抗体均有较高的效价，且效价水平相差不大，说明两种抗原均可刺激动物产生免疫学反应。对比而言，表达蛋白制备的多抗较病毒制备的多抗灵敏度和特异性要好一些。因此，表达的重组蛋白可以应用于ELISA等免疫学检测方法的研究。重组蛋白的成功表达和复性为今后GCRV单克隆抗体的制备提供了较好的方法，也为进一步制备免疫学方面的检测试剂盒研究工作提供了科学依据。

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