外源蛋白酶对虹鳟生长和肠道组织结构的影响

张娟娟，李小勤、2，冷向军、2，韩志英，张飞鸽

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;2.农业部淡水水产种质资源重点试验室，上海201306)

虹鳟Oncorhynchus mykiss是一种名优冷水养殖鱼类，具有营养丰富、肉质鲜嫩的特点。虹鳟属肉食性鱼类，对蛋白质的需求比较高，虹鳟养殖技术规范——配合颗粒饲料 SC/T 1030.7—1999［1］中规定，虹鳟成鱼阶段的饲料粗蛋白含量≥40%。通常情况下，饲料配方中需要35%～40%的鱼粉方可满足其营养需求。但是，近年来鱼粉价格昂贵，资源短缺，为降低养殖成本，有效的方法就是在补充限制性氨基酸的基础上，以植物性蛋白替代部分鱼粉，同时添加酶制剂，如蛋白酶等，以提高植物性蛋白源的利用率。乌兰等［2］在饲料中添加0.05%、0.10%、0.15%耐高温酶制剂 (以蛋白酶为主)饲喂奥尼罗非鱼56 d，添加量为0.10%时，显著提高了鱼体增重率，降低了饲料系数。刘鼎云等［3］在鱼粉含量为26.4%的饲料中添加175 mg/kg蛋白酶AG，凡纳滨对虾的增重率提高了10.8%，达到了与高鱼粉组 (33%鱼粉含量)基本一致的增重水平。此外，对鲤［4］、奥尼罗非鱼［5］的研究表明，在低鱼粉饲料中添加蛋白酶，能促进鱼体生长，提高营养物质的消化率和肠道蛋白酶活性。

目前，有关蛋白酶应用于水产动物方面的报道，主要集中在对温水性鱼类的研究上，而对冷水性鱼类的研究相对较少。本试验中，作者以虹鳟为研究对象，在鱼粉含量为35%的饲料 (高鱼粉饲料)中，以豆粕和肉骨粉等蛋白源代替20%鱼粉，配制低鱼粉饲料 (鱼粉含量28%)，在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶PT，考察蛋白酶PT对虹鳟生长性能的影响，旨在为蛋白酶在水产饲料中的合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用虹鳟购于黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站，初始平均体质量为 (52.1±0.5)g。选取体质健壮、规格一致的个体135尾，随机分配于9个自动充气循环养殖缸内 (0.60 m×0.60 m×0.50 m)，每缸放15尾鱼;共3个处理组，每个处理组设3个重复。

1.2 方法

1.2.1 试验设计及试验饲料 以鱼粉含量为35%的饲料作为高鱼粉饲料组;在高鱼粉饲料中，用豆粕、肉骨粉替代鱼粉制成鱼粉含量为28%的饲料作为低鱼粉饲料组，同时补充晶体赖氨酸(0.09%)和晶体蛋氨酸 (0.05%)，使赖氨酸和蛋氨酸的含量达到与高鱼粉组一致的水平;在低鱼粉饲料中，添加175 mg/kg蛋白酶PT(加拿大JEFO营养公司生产并提供，为细菌发酵产物，是一种耐高温的微碱性丝氨酸蛋白酶)作为蛋白酶饲料组。饲料配方及营养成分组成见表1。各组原料均粉碎并过40目，逐级混合后，由颗粒饲料机(浙江省新昌县陈氏机械厂生产，KL系列)制成粒径为2.5 mm的硬颗粒沉性饲料，晾干备用。

表1 饲料配方及营养成分组成Tab.1 Ingredients and approximate composition of diet w/%

1.2.2 饲养管理 试验开始前，将虹鳟暂养3周以适应环境。试验正式开始时，3个处理组分别投喂高鱼粉饲料、低鱼粉饲料和蛋白酶饲料，每天投喂2次 (8:30，15:30)，日投饲量为鱼体质量的1.5%～2.5%，并根据温度、摄食和鱼体生长情况适当调整，使各组保持基本一致的摄食水平，以每次投饲后无残饵为宜。试验期间水温为8～14℃，溶氧为6～7 mg/L，pH为7.24～7.78。养殖试验于上海海洋大学鱼类营养实验室进行，养殖周期为60 d。

1.2.3 生长指标的测定

1)生长性能。养殖试验结束后，鱼体饥饿24 h，称重各组鱼，计算增重率、饲料系数、特定生长率和成活率。

增重率(WGR，%)=100×(Wt-W0)/W0，

饲料系数(FCR)=F/(Wt-W0)，

特定增长率(SGR，%/d)=100×［ln Wtln W0］/t，

成活率(SR，%)=100×试验末鱼尾数/试验初鱼尾数，

其中:Wt为终末平均体质量 (g);W0为初始平均体质量 (g);F为饲料摄入量 (g);t为饲养时间(d)。

2)肌肉基本成分分析。试验结束后，每缸取3尾鱼，每个处理组9尾，取背部白肌10 g左右，剪碎成均匀的混合物以测定虹鳟肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。其中，采用105℃恒重法 (GB/T 6435-86)测定水分，采用凯氏定氮法 (GB/T 6432-94)测定粗蛋白，采用氯仿-甲醇抽提法测定粗脂肪，采用550℃灰化法 (GB/T 6438-92)测定粗灰分。

3)胃和肠蛋白酶活力的测定。试验结束后，每缸取3尾鱼，每个处理组9尾，取肠和胃，于-80℃下保存，待测蛋白酶活力。测定时，在4℃下解冻肠和胃，用4℃去离子水漂洗，用纸吸干，称重，加入适量4℃缓冲液，剪碎后用匀浆机在冰浴中匀浆，匀浆液在4℃下以8 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液测定。其中，胃和胃糜添加0.1 mol/L的KCl-HCl缓冲液 (pH 1.5)，肠添加0.05 mol/L 的 Tris-HCl缓冲液 (pH 8.5)［6］。采用福林酚试剂法测定蛋白酶活力［7］。

胃蛋白酶活力定义:在pH为1.5和40℃水浴中保温10 min，每g鲜样组织每min水解酪蛋白产生1 μg酩氨酸定义为一个酶活力单位 (U)。

肠蛋白酶活力定义:在pH为8.5［8］和40℃水浴中保温10 min，每g鲜样组织每min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为一个酶活力单位 (U)。

4)前肠组织切片。采样时，取前肠于波恩(Bouins)试剂中固定，用体积分数为100%的酒精冲洗，用不同浓度的酒精脱水，用二甲苯透明、石蜡包埋，固定在木块上，在切片机上连续切片(厚度为5 μm)，然后贴片、烘片、脱蜡、复水、H.E染色、脱水透明、中性树胶封片，风干后，于Olympus光学显微镜下观察肠道结构并拍照。

1.3 数据处理

试验数据采用 (平均数±标准差)表示，用SPSS 17.0进行单因素方差分析，如差异有显著性，用Duncan氏法进行多重比较，差异显著性水平设为0.05。

2 结果

2.1 蛋白酶对生长性能和肌肉成分的影响

养殖60 d后，各组虹鳟的生长性能见表2。低鱼粉组虹鳟的增重率低于高鱼粉组 (P＜0.05)，而饲料系数却高于高鱼粉组 (P＜0.05);蛋白酶组虹鳟的增重率为96.82%，比低鱼粉组提高9.42%，饲料系数为1.41，比低鱼粉组降低7.80%;蛋白酶组虹鳟的增重率、饲料系数与高鱼粉组相比均无显著性差异 (P＞0.05);各处理组虹鳟肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量间均无显著性差异 (P＞0.05)(表3)。

表2 对虹鳟生长性能的影响Tab.2 Effects of various diets on growth performance in rainbow trout

表3 对虹鳟肌肉成分的影响Tab.3 Effects of different diets on muscular approximate composition in rainbow trout w/%

2.2 蛋白酶对虹鳟肠、胃蛋白酶活力的影响

从表4可见:高鱼粉组和蛋白酶组虹鳟肠蛋白酶和胃蛋白酶活力均高于低鱼粉组 (P＜0.05)，但蛋白酶组、高鱼粉组虹鳟肠蛋白酶和胃蛋白酶活力间无显著性差异 (P＞0.05)。

表4 对虹鳟肠、胃蛋白酶活力的影响Tab.4 Effects of different diets on intestinal and gastric protease activities in rainbow trout U/g

2.3 蛋白酶对虹鳟前肠组织结构的影响

对虹鳟前肠组织切片，观察并测量前肠皱襞高度和面积。由表5可见，高鱼粉组和蛋白酶组前肠皱襞高度和面积均高于低鱼粉组 (P＜0.05)，但高鱼粉组、蛋白酶组的前肠皱襞高度和面积均无显著性差异 (P＞0.05)。从图1-A、C可见，高鱼粉组和蛋白酶组肠绒毛发达，排列整齐完整，固有层结缔组织、黏膜肌和肠绒毛连接紧密;从图1-B可见，低鱼粉组肠绒毛的高度低于高鱼粉组和蛋白酶组 (P＜0.05)，部分肠绒毛与黏膜肌分离，黏膜肌和结缔组织较疏松，肠绒毛变短且前端有损伤。

图1 虹鳟前肠组织结构 (×4)Fig.1 The tissue structure of foregut in rainbow trout(×4)

表5 蛋白酶对虹鳟前肠组织结构的影响(n=6)Tab.5 Effects protease addition on the structure of foregut tissue in rainbow trout(n=6)

3 讨论

Cheng等［9］和 Gaylord 等［10］的研究均表明，虹鳟能够有效利用饲料中添加的外源晶体氨基酸。但在本试验中，低鱼粉饲料补充赖氨酸、蛋氨酸后，尽管其赖氨酸、蛋氨酸达到与高鱼粉组一致的水平，但虹鳟的鱼体增重率仍显著低于高鱼粉组，仅相当于高鱼粉组的89.8%(表2)，而饲料系数却显著升高。这说明，以植物蛋白、肉骨粉部分代替鱼粉后，单纯通过补充限制性氨基酸，仍难以达到理想的生长效果，其原因可能与植物蛋白、肉骨粉的消化率低以及缺乏一些未知生长因子等 (相对于鱼粉而言)有关［11-12］，因此，通过在饲料中添加酶制剂，提高营养物质消化率，是减少鱼粉用量，提高替代蛋白源利用率的有效途径。

蛋白酶是催化分解肽键的一类酶的总称，能将蛋白质降解为小分子的蛋白胨、肽和氨基酸，从而提高蛋白质的消化利用率。冷向军等［13］在鱼粉含量为10%的饲料中添加175 mg/kg蛋白酶AG后，鲤增重率提高9.1%，饲料系数降低9.9%，同时也提高了肠道蛋白酶活性;乌兰等［14］在对奥尼罗非鱼的研究中，添加0.1%的金属蛋白酶，可提高前肠蛋白酶活力18.83%，肠道皱襞高度也得到显著提高;Drew等［15］用豌豆替代鱼粉，添加 250 mg/kg蛋白酶后，虹鳟摄食量显著增加，饲料系数显著降低;此外，蛋白酶应用在肉仔鸡［16］、仔猪［17］、奶 牛［18］、异育银鲫［19］、 草 鱼［20］、 黄 颡鱼［21］等的研究均表明，蛋白酶具有促进动物生长、降低饲料系数、改善肠道组织结构、提高消化酶活性和饲料利用率的作用。添加外源性消化酶提高消化道酶活性的原因，一方面可能是外源性消化酶直接参与对饲料成分的分解，另一方面可能是促进了内源性消化酶的分泌，与外源酶共同作用，从而提高鱼体对营养成分的消化和吸收，促进鱼体生长。

本试验中，低鱼粉饲料组的虹鳟增重率及肠、胃蛋白酶活性最低，前肠组织学观察也表明肠绒毛有部分损伤，这来源于植物蛋白相对较低的消化率及抗营养因子的危害;在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶后，虹鳟增重率、饲料系数均得到了改善，虽未达到显著水平，但与高鱼粉组相比，已无显著性差异;此外，虹鳟肠、胃蛋白酶的活性有显著提高，肠绒毛发达且排列整齐，皱襞高度和面积显著增加，增加了肠道对营养物质的吸收面积，这说明蛋白酶的添加能促进虹鳟肠道结构的改变，提高虹鳟对饲料的消化吸收率，从而促进其生长。

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