滇中蛹草拟青霉活性成分分析*

王百乐，虞泓，曾文波，赵舒涵，杨俊媛，陈自宏

（云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室昆明650091）

蛹虫草与冬虫夏草同属不同种，在化学成分与功效上十分相似，可作为冬虫夏草的有力替代品[2~5]。

冬虫夏草主要分布于我国西藏、甘肃、青海、云南等地[9]，而蛹虫草在全球分布广泛[10]，在我国主要分布于湖北、河北、吉林、陕西、安徽、云南、广西、贵州、四川、台湾等省区[9]，在云南滇中、滇东南、滇西南、滇西、滇西北等地区均有蛹虫草分布记载[11]。由于过渡挖掘和生态环境的破坏，野生冬虫夏草资源接近枯竭，而冬虫夏草的人工种植至今尚未取得突破性进展。与冬虫夏草同属的蛹虫草作为虫草属真菌的模式种，在90年代初人工种植就取得了成功[12-13]。目前，蛹虫草人工培养技术已经十分成熟，辽宁、云南、贵州等地已实现人工蛹虫草培养的产业化，一定程度解决了野生冬虫夏草资源匮乏，价格昂贵的问题。

目前，国内对野生蛹虫草或野生蛹虫草分离所得菌株人工培养菌丝体、子实体的化学活性成分、药效药理研究较多，但研究对象主要是产自我国北方温带地区[14-17]，杨钟林等[18]对产自云南中部地区野生蛹虫草生物学及其生态学习性进行了初步研究，而关于云南亚热带地区蛹虫草菌株化学活性成分和药效药理，迄今为止尚未见研究报道。本试验就是以采自云南中部地区野生蛹虫草和人工培养蛹虫草子实体分离得到的菌株为主要材料，对其在人工栽培条件下菌丝体的虫草多糖和虫草酸含量进行测定分析，以野生蛹虫草和冬虫夏草为对比。通过比较其差异，探讨不同居群蛹虫草在不同地理环境下活性成分含量差异可能存在的原因。通过对菌株间多糖、虫草酸含量的比较，筛选出多糖、虫草酸含量高的优质菌株，为今后的生产提供更为优质的菌株。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

本试验材料为从云南和辽宁获得的8个居群蛹虫草菌种分离得到的72株菌株在本实验室培养得到的菌丝体，以野生蛹虫草和冬虫夏草为对比，见表1。

表1 试验材料

1.2 试验仪器

电子天平，生化培养箱，控温摇床，电热恒温水槽，电热恒温水浴锅，艾柯超纯水机，漩涡混合器，紫外分光光度计，电动离心机，循环水式真空泵，电热鼓风干燥箱，高速万能粉碎机。

1.3 试验试剂

醋酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸钾、浓硫酸、盐酸、无水乙醇、苯酚等均为国产分析纯，L-鼠李糖为国药集团化学试剂有限公司进口分装，标准品甘露醇购自中国药品生物制品检定所，葡聚糖Dextran-40购自BIO BASIC INC，水为蒸馏水。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

将已从新鲜虫草样品的菌核或子实体中分离出的蛹虫草菌株在固体PPDA培养基 （1%蛋白胨+PDA）平皿中25℃活化培养5 d，取1 cm2大小的菌块放入含100 mL无菌液体PPDA培养基的三角瓶中，置于转速为120 r·min-1的摇床上25℃恒温摇菌培养10 d，再静止培养20 d，将三角瓶中的菌丝体取出于40℃恒温干燥，然后用高速粉碎机粉碎至80目细度待用。对照用的野生蛹虫草和冬虫夏草经40℃恒温干燥后用高速粉碎机粉碎至80目细度待用。

1.4.2 虫草多糖测定方法--苯酚-硫酸法[19]

样品多糖含量测定：称取样品0.2500 g，加蒸馏水30 mL，热回流2 h后趁热抽滤，用蒸馏水洗残渣，将滤液、洗液合并，定容至50 mL。量取定容好的溶液20 mL，置于挥发皿中挥干。将挥发后剩余物用1 mL蒸馏水溶解置于10 mL离心管中，加5 mL无水乙醇，混匀，置于离心机中4 000 r·min-1离心15 min，弃上清液。沉淀物加蒸馏水、无水乙醇及离心过程再重复2次。然后取沉淀物用蒸馏水溶解定容至50 mL作为样品液待用。吸取2 mL样品液至20 mL试管中，加入1 mL5%苯酚溶液，混匀，快速加入7 mL浓硫酸，混匀，置于40℃水浴中30 min，再置于冰水浴中5 min，之后快速升至室温，用分光光度计测定490 nm波长吸光度。以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为空白对照。

标准曲线绘制：称取分子量为4万的葡聚糖0.0500 g，定容至50 mL备用。分别取配好的葡聚糖标准品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于100mL容量瓶中，定容，配成质量浓度为 10 mg·L-1、 20 mg·L-1、 30 mg·L-1、 40 mg·L-1、 50 mg·L-1葡聚糖标准品溶液，按 “多糖测定方法”进行操作。以蒸馏水为空白，在490 nm波长处分别测定各标准品的吸光度。以葡聚糖质量浓度ρ为纵坐标、吸光度A为横坐标绘制标准曲线，并求出回归方程。本文计算样品多糖含量使用分子量4万葡聚糖得到的回归方程为ρ=84.458A-1.2272，R2=0.9998，吸光度在0.2～0.8之间，具有良好的线性关系。

1.4.3 虫草酸测定方法[19]

样品中虫草酸总含量测定：称取样品0.2500 g，加蒸馏水30 mL，热回流2 h后，趁热抽滤，用蒸馏水洗残渣，将滤液、洗液合并定容至50 mL。量取定容好的溶液1 mL，加入20 mL试管中，加1 mL高碘酸钾 （0.350 g高碘酸钾用0.12 mol·L-1盐酸定容至100 mL）溶液，混匀，室温放置10 min，加2 mL0.1%L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，混匀，加入4 mL新鲜配制的NaSh（7.500 g醋酸铵+100 μL冰醋酸+100 μL乙酰丙酮，定容至 50 mL）试剂，53℃水浴加热15 min，之后快速冷却至室温，用分光光度计测定412nm波长处吸光度。以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为空白对照。

标准曲线绘制：称取甘露醇标准品0.0500 g，定容至50 mL备用。分别取配好的标准品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于100 mL容量瓶中，定容，配成质量浓度为 10 mg·L-1、 20 mg·L-1、 30 mg·L-1、 40 mg·L-1、50 mg·L-1的甘露醇标准品溶液，按 “虫草酸测定方法”进行操作。以蒸馏水为空白，分别测定412 nm波长处各标准品的吸光度。以甘露醇质量浓度ρ为纵坐标、吸光度A为横坐标绘制标准曲线，并求出回归方程。回归方程为ρ=97.836A+0.1873，R2=0.9996，吸光度在 0.2～0.8 之间，具有良好的线性关系。

1.5 数据统计分析

1.5.1 描述性分析

对各居群菌株多糖、虫草酸的测定数据用SAS 8.1软件分别进行最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数分析。

1.5.2 单因素方差分析

对测定数据用SAS 8.1软件进行单因素方差分析，F检验(α=0.05)差异显著者，采用Duncan's多重极差检验[20]，分析比较不同居群间的差异，以及各居群内多糖、虫草酸含量最高的菌株间的差异，结果用±S表示。

2 结果与分析

2.1 居群间多糖、虫草酸含量描述性分析结果

从表2、表3可以看出：居群间多糖含量平均值从大到小依次为嵩明居群 （SM）＞西山居群 （XS）＞金殿居群（JD）＞野鸭湖居群 （YY）＞白马雪山冬虫夏草居群 （BM）＞紫溪山居群 （ZX）＞香格里拉居群 （ZD）＞玉溪居群（YX） ＞沈阳居群 （SY） ＞嵩明野生蛹虫草居群 （SMY）；居群间虫草酸含量平均值从大到小依次为白马雪山冬虫夏草居群 （BM）＞嵩明野生蛹虫草居群 （SMY）＞嵩明居群（SM） ＞西山居群 （XS） ＞野鸭湖居群 （YY） ＞居群沈阳（SY） ＞紫溪山居群 （ZX） ＞玉溪居群 （YX） ＞香格里拉居群 （ZD）＞金殿居群 （JD）。多糖含量与虫草酸含量大小顺序并不一致，显示多糖含量与虫草酸含量无较好的相关性。就菌丝体而言，云南地区菌丝体多糖平均含量明显高于东北地区菌丝体多糖平均含量，而虫草酸含量略高于东北地区菌丝体虫草酸含量。其中嵩明居群 （SM）与西山（XS）居群菌丝体多糖和虫草酸含量最高，可以为生产提供较为优质的菌株来源。

表2 各居群多糖含量描述性分析

表3 各居群虫草酸含量描述性分析

表4 居群间菌株多糖、虫草酸含量比较结果*

2.2 居群间菌株多糖、虫草酸含量方差分析结果

从表4可以看出：居群间多糖含量差异显著 （F=8.064，P<0.05），其中：来自嵩明居群 （SM）菌丝体的多糖含量最高，达 (70.65±39.37)mg·g-1，嵩明野生蛹虫草居群 （SMY） 最低， 仅为8.58±3.20 mg·g-1。 居群间虫草酸含量差异显著 （F=10.439，P<0.05），其中，白马雪山冬虫夏草居群 （BM）的虫草酸含量最高，达 (93.44±93.44)mg·g-1，金殿居群 （JD） 菌丝体的虫草酸含量最低，为(38.064±15.04)mg·g-1。

表5 各居群菌丝体多糖含量最高菌株多糖含量比较结果*

2.3 各居群多糖含量最高菌株比较结果

从表5可以看出：各居群中多糖含量最高的菌株多糖含量差异极显著 （F=195.459，P<0.01）。 嵩明居群 （SM）的cmilSM5号菌株多糖含量最高，达到 (172.15±5.07)mg·g-1。沈阳居群 （SY）的 cmilSY16号菌株最低，仅为(15.40±4.55)mg·g-1。二者多糖含量相差超过10倍之多。

2.4 各居群虫草酸含量最高菌株比较结果

表6 各居群菌丝体虫草酸含量最高菌株含量比较结果*

从表6可以看出：各居群中虫草酸含量最高的菌株虫草酸含量差异极显著 （F=457.046，P<0.01）。嵩明居群（SM）的cmilSM5号菌株含量最高，达到 （115.96±3.31）mg·g-1；玉溪居群 （YX）的cmilYY1号菌株最低，仅为（54.36±1.52） mg·g-1，2 者相差超过 2 倍。

图1 各居群菌丝体的AVE聚类法谱系聚类图

2.5 各居群Q-聚类分析

从图1可以看出：沈阳居群 （SY）与玉溪居群 （YX）首先聚为一支后，依次和紫溪山居群 （ZX）、香格里拉居群 （ZD）、 金殿居群 （JD） 聚为一支； 野鸭湖居群 （YY）与西山居群 （XS）聚为一支；嵩明居群 （SM）单独聚为了一支。聚类结果与Duncan's多重极差检验结果基本一致，不同居群间化学成分存在较为明显的差异性。

3 讨论

虫草多糖和虫草酸为虫草真菌的次生代谢产物，其含量与菌株自身的遗传特性及其生长的生态环境有很大关系。研究表明，不同居群间多糖和虫草酸含量差异显著；多糖与虫草酸含量无明显相关性；野生蛹虫草与冬虫夏草虫草酸含量大致相当，野生蛹虫草多糖含量略低于冬虫夏草多糖含量，与张显科研究的结果一致[16]。

研究发现，不同生态地理来源的居群间，其菌株多糖和虫草酸含量差异显著。沈阳居群 （SY）、玉溪居群（YX）和香格里拉居群 （ZD）菌株，与其他居群菌株相比，其多糖和虫草酸平均含量均较低，三者间多糖和虫草酸含量无统计学差异；嵩明居群 （SM）和西山居群（XS），其多糖和虫草酸平均含量较高，多糖含量显著高于沈阳居群 （SY）、 玉溪居群 （YX）、 香格里拉居群 （ZD），虫草酸含量略高于上述三个菌株来源于我国东北地区的居群。由此可见，来源于我国东北地区的蛹虫草菌株，其多糖和虫草酸平均含量明显低于来自滇中地区蛹虫草菌株。滇中地区的蛹虫草菌株间，其多糖和虫草酸含量差异也极为显著，尤以嵩明居群 （SM）的cmilSM5号菌株、西山居群 （XS）的cmilXS10号菌株和野鸭湖居群 （YY）的cmi lYY9以及cmilYY14号菌株最为突出，多糖和虫草酸含量比较高，显著高于其他菌株，可作为产业化生产虫草多糖和虫草酸的优质菌株来源。

本次试验，用嵩明野生蛹虫草 （SMY）和白马雪山冬虫夏草 （BM）作为对照，比较发现，野生蛹虫草和冬虫夏草虫草酸含量高于所培养的蛹草拟青霉菌丝体，但其多糖含量却低于所培养蛹草拟青霉菌丝体，其中嵩明野生蛹虫草 （SMY）虫草酸含量最高，多糖含量却最低。

研究材料主要来自于滇中地区野生蛹虫草分离菌株所培养的菌丝体，分析表明，嵩明居群 （SM）和西山居群（XS）菌丝体多糖和虫草酸平均含量较高，可以作为蛹虫草人工培养供选育的菌种来源。有意义的是，不同地理环境下生长的蛹虫草及其菌丝体，其不同活性成分含量存在较大差异，可以为规模化选育和培养不同活性成的蛹虫草及其菌丝体提供丰富的遗传种源；也将为深入开发高含量的不同活性成分的蛹虫草及其菌丝体产品奠定基础。

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