野生灵芝菌种培养基筛选的研究*

袁学军，李艳丽，陈永敢，张 恒

（琼州学院生物科学与技术学院，海南 三亚 572000）

灵芝 (Ganoderma lucidum)隶属真菌门 (Eumycota)，担子菌亚门 (Basidiomycotina)，层担子菌纲 （Hymeno mycetes）,无隔担子菌亚纲 (Holobasidiomycetidae)，非褶菌目 (Aphyllophorales)[1]。灵芝主要分布在亚洲、澳洲、非洲及美洲的热带及亚热带，少数分布于温带。地处北半球温带的欧洲仅有灵芝属的4种，而北美洲大约5种。我国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广[2]。海南岛地处北半球热带区，其丰富的水热资源和复杂的地形条件，有利于灵芝真菌的生长繁殖，这就决定了海南岛灵芝资源是国内外最丰富的地区，在我国灵芝在海南的分布种类最多，计78种,分属4属、3亚属、2个组[3]，占全国灵芝科的53.6%[2]。

灵芝的生物活性成分十分丰富，丰富的生物活性成分决定了它功能的多样性[4]。据有关研究表明，目前已分离到灵芝的150余种活性成分，有多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸、蛋白质类、三萜类和矿质元素等[5]，具有抗肿瘤、保肝解毒、预防心血管系统疾病、抗过敏、抗衰老、抗神经衰弱、治疗高血压、慢性支气管炎、支气管哮喘等作用[6]。除医学外，灵芝在食品、饮品以及保健品产业都占有一定的市场与地位，具有较高的观赏价值及经济价值[7]。灵芝既不同于一般药物对某种疾病起治疗作用，亦不同于一般营养保健食品只对某一方面营养素的不足进行补充和强化，它的独特之处主要在于它是在整体上双向调节人体机能平衡，调动机体内部活力，调节人体新陈代谢，提高自身免疫能力，促使全部的内脏或器官机能正常化，从而从根本上达到治病强身保健的目的[6]。

近年来，灵芝的开发利用越来越受到人们的重视，消费量增长很快，种植面积不断扩大，但存在着菌种成活率低、发菌慢、结皮老化、出芝表面木栓化、生物转化率低、成本高、质量不稳定等现象，造成经济效益不高[8]。造成这些现象的主要原因是菌种质量差[9]。能否培育优质菌种的关键是适宜的培养基配方[10]。本实验设计多个菌种培养基配方,筛选出最适于灵芝培养的母种培养基、原种培养基、栽培种培养基配方，为了能够更有效地进一步研究和开发利用真菌资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种:7号五指山地区野生灵芝

1.1.2 药品材料:马铃薯、琼脂、葡萄糖、蔗糖、木屑、麦麸、棉籽壳、石膏、75%酒精、95%酒精。

1.2 方法

1.2.1 培养基配方

母种培养基的配方:

（1）PDA：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、1 000 mL； （2）PSA：马铃薯 200.0 g、 蔗糖 20.0 g、琼脂 20.0 g、 水 1 000 mL； （3）PDA+K++Mg2+：马铃薯200.0 g、 葡萄 糖 20.0 g、 琼脂 20.0 g、KH2PO43 g、Mg SO41.5 g、1 000 mL； (4)PDA+木屑： 马铃薯200.0 g、 葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、100 g木屑取汁1 000 mL；

原种和栽培种培养基的配方:

（1） 木屑 990 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （2） 木屑790 g、 麦麸200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （3） 棉籽壳790 g、 麦麸 200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （4）棉籽壳990 g、石膏10 g和水1 300 mL。

1.2.2 培养基的制作与培养

母钟按常规方法制作平板培养基，121℃，灭菌20min，培养基灭菌之前pH调整为6.5，总共4个处理，每个处理4个重复。

原种和栽培种按常规方法制，原种用瓶，栽培种用袋，121℃，灭菌2 h，培养基灭菌之前pH调整为6.5，总共4个处理，每个处理4个重复。

培养的条件为：室温 （25±2）℃，湿度为60%～65%，黑暗。

1.2.3 测量和观察的指标

母钟第7天时测量菌丝的速度 （生长速度/cm·d-1=菌丝长度cm/d），观察菌丝的粗度 （粗、中等、细）、生长势（强、中等、弱）、疏密程度 （较密、密、疏）、颜色。

原种和栽培种第12天时测量菌丝的速度，观察菌丝的粗度 （较粗、粗、细、较细）、生长势 （较强、强、弱、较弱）、疏密程度 （较密、密、疏、较疏）、颜色。并记录长满瓶和袋的天数。

1.2.4 统计分析

用南京农业大学王韶华教授发明的stst软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方对母种生长的影响

图1 不同培养基配方对母种菌丝生长的影响

表1 不同培养基配方对母种生长的影响

不同培养基配方对母种菌丝生长的影响 （图1和表1），结果显示在4种培养基上菌丝的生长速度存在极显著性差异，灵芝菌丝在PDA+木屑培养基上生长速度最快，其生长速度为1.213 cm·d-1，菌丝较细、较密、纯白、生长势最强；在PDA培养基上生长速度次之，其生长速度为1.15cm/d，菌丝细、密、纯白、生长势强；在PSA培养基上生长速度较慢，菌丝较粗、疏、纯白、生长势弱；PDA+K++Mg2+培养基上，生长速度最慢，菌丝体较粗、较疏、纯白、生长势最弱。

图2 不同培养基配方对原种生长的影响 （第12d）

表2 不同培养基配方对原种生长的影响

因此，根据综合指标，PDA+木屑培养基为母种最佳培养基。

2.2 不同培养基配方对原种生长的影响

图2和表2显示，灵芝菌丝在棉籽壳培养基上的生长速度最快，其生长速度为4.778 mm·d-1，菌丝最粗壮、浓密、纯白，但是满瓶后出现了发黄现象，满瓶时间为16 d；在棉籽壳+麦麸培养基上生长速度为4.052 mm·d-1，生长速度次之，菌丝较粗壮、浓密、纯白，满瓶后无发黄现象，满瓶时间为20 d；木屑+麦麸培养基的生长速度较慢，其生长速度为3.657 mm·d-1，菌丝粗壮，稍稀疏，纯白，满瓶后无发黄现象，满瓶时间为23 d；木屑培养基的生长速度最慢，刚开始生长情况不良，几乎不长，其生长速度为2.453 mm·d-1，满瓶时间为32 d。综合各种指标棉籽壳培养基更适合灵芝的培养，但是棉籽壳培养基后期容易发生黄化现象，在生产中要注意及使用。

图3 不同培养基配方对栽培种生长的影响

3 不同培养基配方对栽培种生长的影响

灵芝在棉籽壳培养基上的生长速度最快，其生长速度为4.366 mm·d-1，满袋时间为40 d；棉籽壳+麦麸培养基上的生长速度次之，其生长速度为3.796mm·d-1，满袋时间为45 d；木屑+麦麸培养基的生长速度较慢，其生长速度为3.269 mm·d-1，满袋时间为51 d；木屑培养基的生长速度最慢，刚开始生长情况很不好，几乎不长，其生长速度为2.135mm·d-1，满袋时间为61 d。综合各种指标，栽培种最适培养基为棉籽壳，结果和原种培养基类似。

表3 不同培养基配方对母种生长的影响

4 讨论与结论

菌种质量的好坏直接影响到栽培能否成功和产量、质量，菌种的质量受多种因素的影响，但最关键因素为培养基的营养状况，因此，培养基的选择具有重要意义。

母种质量的标准： （1）转管次数：最多不超过4次~5次； （2）菌龄：低温保存不超过6个月； （3）外观：菌丝浓白、粗壮、富有弹性、爬瓶力强，没有干燥、收缩现象和大量红褐色液体； （4）长势：菌丝生长快、整齐、浓而健壮； （5）温度适应性：在适温培养后，放在高温下培养几小时，菌丝仍能健壮生长的； （6）干湿性鉴定；（7）出菇试验。原种和栽培种的质量标准： （1）菌丝生长健壮，绒状菌丝多，生长整齐； （2）菌丝己长滿培养基，有的要求有分化的子实体原基。有菇香味，无异味；（3）菌丝色泽洁白或符合该菌的颜色； （4）菌种瓶内无杂色出现和无杂菌污染； （5）菌种瓶内无黄色汁液渗出；（6）菌种培养基不能干缩与瓶壁分开。

在本试验中灵芝菌丝在PDA+木屑培养基上生长良好，可能是由于灵芝属木腐型真菌，在PDA+木屑培养基中，木屑过滤液可提供木质中的营养；在菌丝生长过程中，必须提供充足且均衡的营养，菌丝才能生长良好，营养缺乏后过剩都影响菌丝的生长，在本试验中，纯木屑培养基营养缺乏，菌丝生长不良。但棉籽壳本身营养丰富，已经能满足菌丝的生长，在加入麦麸后由于营养过剩，菌丝反而生长不良。

总之，依据菌种质量标准，综合各种试验指标，野生灵芝母种最佳培养基为PDA+木屑培养基，原种和栽培种最佳培养基均为棉籽壳，本试验为生产优质的灵芝菌种提供可靠的参考依据。

[1]赵继鼎．中国灵芝新编[M]．北京：科学出版社，1989．

[2]贾定文，郑林用．灵芝属真菌分类研究现状及分析 [J]．西南农业学报，2003，16：64-68．

[3]吴兴亮．中国海南岛灵芝资源及其分布特征[J]．菌物系统,1998，17(2)：27-31．

[4]Yue Q X,Guan S H.Interaction of Ganoderma triterpenes With Docetaxel and Cisplatinin Cytotoxicity against Human CarcinomaCells[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2008,6(5):367-371.

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[6]刘存芳．灵芝营养成分综述[J]．南江科技,2008， (5)：122-129．

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[8]蒋冬花．培养基配方与栽培方式对灵芝产量和质量和影响 [J]．海南大学学报 (自然科学版)，2001，19(1)：76-79．

[9]Roberta S,Paola C.Biochemical characterisation and antioxidant ac tivity of mycelium of Ganoderma lucidum from Central Italy[J].Food Chemistry，2009，116：145.

[10]初洋，倪新江．灵芝培养基的筛选 [J]．安徽农业科学,2008,36（5）：1924-1925.