甘南州尖顶羊肚菌菌丝体液体发酵培养研究

康小虎，蔡亚东，孙宜法，谢 放，任爱梅，孟宪刚

（兰州交通大学化学与生物工程学院生物工程系，甘肃 兰州 730070）

羊肚菌又名羊肚菜，是一种野生名贵食（药）用真菌，因其菌盖表面呈许多小凹坑，外观极似羊肚而得名。尖顶羊肚菌（Morchella conica）是羊肚菌中非常重要的一类，其菌体内含有多糖等活性成分，能增强人体的免疫功能，具有较强的抗衰老、抗肿瘤等作用[1，2]。我国羊肚菌分布广泛,主要分布在甘肃、青海、四川、云南、黑龙江等地。甘肃羊肚菌资源主要分布在甘南州、天水、陇南、庆阳等地，其中甘南藏族自治州山区尖顶羊肚菌分布较多，以尖顶羊肚菌（M.conica）、小羊肚菌（M.deliciosa）、小顶羊肚菌 （M.angusticeps）、粗柄羊肚菌 （M.crassipes）最为常见[3]。其中尖顶羊肚菌营养丰富，氨基酸、矿物质和微量元素种类齐全，含量丰富[4]，很有研究价值，但目前关于甘南州羊肚菌的研究开发工作鲜见报道。另一方面，羊肚菌子实体的人工栽培是非常困难的，但所幸的是羊肚菌的菌丝体在营养成分上与子实体相当[5]，因此，研究羊肚菌菌丝体液体发酵培养技术，对甘南州羊肚菌资源的开发利用意义重大。本文研究了甘南藏族自治州尖顶羊肚菌液体发酵培养的最优培养基组分和最佳培养条件，为其工业化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

采自甘肃省甘南州迭部县的尖顶羊肚菌，由兰州交通大学种苗工程研究所保存。

1.1.2 培养基

斜面种子培养基（PDA）：马铃薯（去皮） 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、琼脂 18 g·L-1，自然 pH。

液体种子培养基：马铃薯（去皮） 100 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 20 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、维生素 B10.03 g·L-1，pH 7.0。

液体发酵培养基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、维生素 B10.03 g·L-1，pH7.0。

1.1.3 主要仪器设备

气浴恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、超净工作台、电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

斜面菌种接种于PDA平板上，25℃静置避光培养4 d~5 d，菌丝可长满平板。

1.2.2 液体菌种培养

从活化好的羊肚菌PDA平板上用打孔器取得约1 cm2的菌丝体，接入到装有100 mL液体种子培养基的三角瓶（250 mL） 中，置于25℃、100 r·min-1的摇床上避光培养4 d，即可作为液体发酵菌种备用。

1.2.3 液体发酵培养基优化实验

（1）碳源、氮源单因素筛选试验

碳源筛选实验：以2%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖的替液体发酵培养基中的葡萄糖作为碳源，其它组分和液体发酵培养基相同。接种量为10 mL，25℃、120 r·min-1摇瓶培养7 d。重复实验3次，测定菌丝体生物量。

氮源筛选实验：以1%的蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵代替液体发酵培养基中的酵母浸膏作为氮源，其它组分和摇瓶发酵培养基相同。接种量为10 mL，25℃、120 r·min-1条件下，摇瓶培养7 d。重复实验3次，测定菌丝体生物量。

（2）无机盐筛选实验

根据王小雄[4]对甘肃甘南州羊肚菌营养成分分析和王新宇[6]对甘南州羊肚菌菌丝体生长的研究，选取KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4以及CaCl2七种无机盐，设计L8(27)正交试验，试验方案见表1。

表1 无机盐正交试验方案

（3）液体发酵培养基组分优化实验

根据碳源、氮源单因素实验结果和无机盐正交实验结果，以干菌丝体得率为考量指标，综合考虑原料来源和价格因素，选择影响羊肚菌干菌丝体得率的主因素。碳源为白砂糖，氮源为豆粕粉，无机盐为 MgSO4·7H2O和KH2PO4。另外，任桂梅[7]等的研究认为维生素B1作为生长因子对食用菌菌丝体的生长影响明显，故将维生素B1作为生长因子，设计L16(45)正交试验，试验方案见表2。

表2 发酵培养基组分正交试验方案

1.2.4 液体摇瓶发酵条件的优化

在最佳发酵培养基成分的基础上，以不同温度、初始pH值、接种量、培养时间和转速，设计L16(45)正交试验，以干菌丝体得率为指标，确定最佳发酵条件，试验方案见表3。

表3 液体发酵条件正交试验方案

1.2.5 干菌丝体得率的计算

发酵液用纱布过滤，所得菌丝球用去离子水清洗3次~5次，置于80℃烘箱中干燥2 h至恒重，计算干菌丝体得率。干菌丝体得率（P，g·L-1）公式为：

式中：m为干菌丝体质量（g）；v为发酵液体积（L）。

2 结果与分析

2.1 碳源、氮源的单因素筛选实验结果及分析

2.1.1 碳源筛选实验

在不同碳源的发酵培养基中，培养7 d后，菌丝体呈现微黄色的菌球，直径为5 mm~15 mm不等，不同碳源生长条件下获得的干菌丝体得率的差异如图1所示。

由图1中可看出，所选碳源均能培养产生菌丝体。蔗糖、葡萄糖和白砂糖作为碳源获得的干菌丝体是相对较高的，分别为 6.86 g·L-1、6.55 g·L-1、6.67 g·L-1，三者之间无明显差异，其主要原因是它们都属于速效碳源，培养初期（5 d前）菌丝体生长很好，但是以葡萄糖为碳源时，在培养后期（5 d后）菌丝体的自溶现象是最明显的。其次是玉米粉（5.12 g·L-1），可溶性淀粉最低（3.94 g·L-1）。综合菌丝体得率、碳源来源、价格等因素考虑，选择白砂糖作为发酵培养基碳源。

2.1.2 不同氮源生长条件下获得的干菌丝体得率情况

不同氮源生长条件下所获得的干菌丝体得率，其差异情况见图2。

图1 不同碳源对干菌丝体得率的影响

所选氮源均能产生一定量的菌丝体。蛋白胨、酵母浸膏和豆粕粉为氮源获得的干菌丝体得率较高，分别是7.63 g·L－1、8.02 g·L－1、7.95 g·L－1，三者之间差异不大，其次是硫酸铵（6.70 g·L－1），氯化铵（5.63 g·L－1）最低。分析原因可能是前三者均属复合型氮源，其中含有羊肚菌生长因子和微量元素，菌丝体的生长速率较快。综合考虑不同氮源干菌丝体得率、原料来源、使用成本等因素，选择豆粕粉为液体发酵培养基氮源。

图2 不同氮源对羊肚菌干菌丝得率的影响

2.2 无机盐筛选实验结果及分析

选取 KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CaCl2七种无机盐，每种无机盐设2水平，设计L8(27)正交试验，试验方案和结果见表4。

以干菌丝体得率为考察指标，极差分析显示无机盐对干菌丝体得率影响主次关系 A（KH2PO4）=C（MgSO4·7H2O）＞G（CaCl2）＞B（K2HPO4）＞D（ZnSO4）＞E（FeSO4·7H2O）＞F（MnSO4），其中KH2PO4和MgSO4·7H2O极差值最大，说明这两种无机盐对菌丝体生长量影响最大，因此选取这两种无机盐为发酵培养基组分。

表4 无机盐正交试验结果及分析

2.3 液体发酵培养基组分优化实验结果及分析

根据碳源、氮源单因素试验结果和无机盐正交试验结果，以干菌丝体得率为考量指标，设计L16(45)正交试验。试验因素包括碳源白砂糖、氮源豆粕粉、无机盐KH2PO4和MgSO4·7H2O，生长因子维生素B1，每因素设四水平，试验方案及结果见表5。

从表中极差值R可以得到发酵培养基的最佳水平组合A3B3C3D2E3，即白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1、维生素 B10.03 g·L－1。

2.4 液体发酵条件的优化

采用优化后的发酵培养基，设计不同温度、初始pH值、接种量、转速和培养时间5个因素，每因素四水平，设计L16(45)正交试验，以干菌丝体得率为考量指标、确定最佳发酵条件，实验方案及结果见表6。

极差分析结果显示最佳液体发酵培养条件组合为A3E4B3C2D2，即最佳液体发酵条件为温度30℃，培养液初始 pH7，接种量 10 mL，转速 120 r·min－1，培养时间为 8 d。

3 结论

本文通过设计正交试验对甘南州尖顶羊肚菌液体发酵培养基和培养条件进行优化。确定的最佳培养基配比为白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H200.5 g·L－1、维生素 B10.03 g·L－1。液体摇瓶发酵的最优条件为温度30℃，培养液初始pH7，接种量10 mL，转速 120 r·min－1，培养时间 8 d。

[1]张松.食用菌学[M].广东：华南理工大学出版社，2000.

[2]李娟，王臻，姚良同，等.羊肚菌多糖研究进展[J].微生物学杂志，2005，25(4)：89－91.

[3]杜品.甘南州林区的大型药用真菌[J].中国食用菌，1999，19(1)：19－20.

[4]王小雄，付华，郑尚珍，等.尖顶羊肚菌深层发酵菌丝体营养成分的研究[J].西北师范大学学报，1997，33（2）：38-40.

表5 液体发酵培养基组分正交试验结果及分析

[5]赵桂云，马庆斌.羊肚菌液体培养基配方的研究[J].食用菌，2002(6)：15-16.

[6]王新宇，梁祖炳，蒲训.三种不同羊肚菌菌丝体的生长、蛋白质合成和酯酶同功酶的组成[J].真菌学报，1996，15(3)：220-226.

表6 液体发酵条件正交试验结果及分析

[7]任桂梅，周茂林，毋楠.维生素B1对几种担子菌菌丝体生长的影响[J].安徽农业科学，2007，35(26)：8075-8076.