北京地区杏鲍菇菌株遗传多样性的RAPD分析

许 峰，刘 宇，尹永刚，王守现，张英春，赵 爽，耿小丽

（北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097）

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，是近年来开发栽培成功、适于工厂化栽培的珍稀食用菌新品种，其风味独特、营养丰富[1]，能够产生多种生物活性分子和酶[2]，且其多糖具有较好的降血糖、增强肌体免疫功能、抗肿瘤和抗氧化活性[3]。因此杏鲍菇具有很高食用、药用、经济和生态价值，市场前景广阔。据北京食用菌协会统计，杏鲍菇在北京市场上已经占食用菌总产量的5.01%。

杏鲍菇遗传多样性研究的开展，对杏鲍菇优良品种的杂交选育、种质资源的保护有着重要的意义。Ro等[4]、尚晓冬等[5]和刘晓红等[6]分别对其收集的不同地区的杏鲍菇菌株进行了RAPD技术分析，但是，针对北京地区主要栽种品种和工厂化生产的杏鲍菇菌株的RAPD分析未见报道。为此，本研究应用RAPD分子标记技术，对北京地区24个杏鲍菇菌种进行遗传多样性分析，为有效培育杏鲍菇优良新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料

本研究所用菌株的名称及来源参见表1。

1.1.2 试剂

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4等化学试剂均为分析纯试剂，购自国药集团北京化学试剂公司；Taq E、dNTP等分子生物学试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司；所用引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

1.1.3 仪器

PCR仪 （Eppendorf Mastercycler Rradien）t、凝胶成像系统 （Bio-Rad）、紫外可见分光光度计 （Labtech UV9100）、电泳仪（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、电子分析天平（奥豪斯）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

表1 供试菌株及其来源

1.1.4 培养基

固体综合PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨 5 g、 KH2PO43 g、MgSO41.5 g、琼脂 20 g、VB110 mg，水 1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 RAPD分析

取PDA平板上活化7 d~10 d的杏鲍菇菌种，刮取少量菌丝作为试验材料，DNA的提取参照许峰等[7]的方法，RAPD扩增反应体系及扩增程序参照范英等[8]的方法。取9 μL PCR扩增产物，1.3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶经EB染色后，置于紫外凝胶成像系统上观察并拍照记录。

1.2.2 数据处理及分析

同一水平上将扩增出的强带或可分辨性好的弱带，均视为扩增阳性赋值“1”，未扩增出条带视为扩增阴性赋值“0”，用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析及主坐标分析。

2 结果与分析

2.1 供试菌株RAPD分析结果

以提取的24个供试杏鲍菇菌株的基因组DNA为模板，通过对40条引物的PCR扩增筛选所获得的9条引物（表2），在供试菌株上电泳效果较好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带,且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。9条引物共扩增出142条DNA片段，不同引物扩增出的DNA条带数从10个~20个不等，其分子量绝大多数为250 bp~2 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息 （图 1）。

表2 RAPD分析用引物

图1 引物S484对24株杏鲍菇菌株的扩增结果

2.2 供试菌株聚类分析结果

综合了9条RAPD随机引物扩增出的142条多态性片段，用NTSYSpc 2.10软件对24个杏鲍菇供试菌株进行聚类分析，获得各菌株间的聚类图，见图2。

图2 杏鲍菇菌株的聚类分析图

在相似系数0.850水平时，可将其余供试菌株分为5大类，第一类包括杏1、杏6和杏22;第二类包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1号、杏14、杏福建（兰田）、杏10、杏11、杏20、杏21、杏16、杏18、杏19、杏13、杏17；第三类有杏23、杏24；第四类为杏3；第五类为杏7。这与本实验室的栽培试验获得的杏3和杏7子实体形状与其它菌株相差很大的结果是一致的。其中第二大类中共包括了17个菌株，在相似系数0.900水平时，又分为五小类，第一类包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1号；第二类包括杏10、杏11、杏20、杏21；第三类包括杏16、杏18、杏19；第四类只有杏13；第五类只有杏17。杏鲍菇菌株的主坐标分析见图3。

图3 杏鲍菇菌株的主坐标分析

对24份材料RAPD标记的原始矩阵进行主坐标分析，前3个主坐标的贡献率分别为17.22%、15.49%和9.55%。从前3个主坐标的三维散点图可以看出，主坐标分析和聚类分析所得结果基本一致。

3 结论与讨论

笔者收集了北京地区24个杏鲍菇栽培品种，并对其基因组DNA进行RAPD扩增和进行遗传多样性分析。聚类分析结果表明，在相似系数为0.850的水平时，可将24个供试菌株分为5大类；主坐标分析结果与聚类分析基本一致。

RAPD技术是1990年由Welsh J和Williams JGK同时建立起来的操作简便、灵敏快速、多态性好的遗传标记[9]。近年来越来越多的研究者将其应用于食用菌类，如香菇、木耳、杏鲍菇等[4，10，11]的种间和种内不同菌株的鉴定研究。刘晓红等[8]应用该技术对国内不同地区的杏鲍菇品种进行遗传多样性分析，将23个供试菌株分为五类，并且有一类菌株较多；分析表明该类菌株由于引种可能来源于同一地区，这与本研究获得的结果一致，说明本研究收集到的北京地区的主要栽培品种的遗传多样性与全国范围的品种多样性一致。

此外，第二大类为生产中主要的栽培菌株，本研究结果表明这些菌株的遗传差异性较小，说明很多菌株都是通过1个或2个优良菌株通过杂交育种手段获得。同时本研究结果还表明，RAPD技术能有效地把杂交菌株与亲本菌株区分开来。

[1]Rodriguez Estrada AE,Jimenez Gasco MM,Royse DJ.Pleurotus eryngii species complex:Sequence analysis and phylogeny based on partial EF1α and RPB2 genes[J].Fungal Biol.,2010,114(5-6):421-428.

[2]Shibata T,Kudou M,Hoshi Y,et al.Isolation and characterization of a novel two-component hemolysin,erylysin A and B,from an edible mushroom,Pleurotus eryngii[J].Toxicon,2010,56(8):1436-1442.

[3]Jung HY,Bae IY,Lee S,et al.Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides[J].Food Hydrocolloid,2011,25(5):1291-1295.

[4]Ro HS,Kim SS,Ryu JS,et al.Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eryngii:ITS sequence analysis,RAPD fingerprinting,and physiological characteristics[J].Mycol.Res.,2007,111(6):710-715.

[5]尚晓冬，宋春艳，沈学香，等.杏鲍菇菌株RAPD指纹图谱分析[J].食用菌学报，2009，16(3)：1-4.

[6]刘晓红，蔡为明，叶爱华，等.杏鲍菇种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].安徽农业科学，2009，37(32)：15728-15729.

[7]许峰，刘宇，王守现，等.一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA提取方法[J].生物技术，2011，21(2)：43-44.

[8]许峰，刘宇，王守现，等.北京地区白灵菇菌株的RAPD分析[J].生物技术，2010，38(15)：21-23.

[9]范英，钟成刚，闫淑珍，等.竹黄菌基因组RAPD分子标记体系的建立[J].生物技术，2010，38(15)：23-26.

[10]Fu LZ,Zhang HY,Wu XQ,et al.Evaluation of genetic diversity in Lentinula edodes strains using RAPD,ISSR and SRAP markers[J].World J.Microb.Biotech.,2010,26(4):709-716.

[11]Yan PS,Luo XC,Zhou Q.RAPD molecular differentiation of the cultivated strains of the jelly mushrooms,Auricularia auricula and A.polytricha[J].World J Microb.Biotech.,2004,20(8):795-799.