蚧虫初孵若虫采集、保存和玻片标本制作1)

赵杰军 王自力 陈晓鸣

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，昆明，650224)

蚧虫属半翅目(Hemiptera)蚧总科(Coccoidea)昆虫的通称，全世界报道蚧虫有7364种［1］，中国记录有1155种［2］。蚧虫的分类鉴定主要依据雌成虫的形态特征，较少涉及初孵幼虫的形态特征。初孵幼虫形态特征种间存在差异，对于种的鉴定具有重要的分类参考价值［3］。此外，蚧虫寄主植物选择机理研究应首先弄清楚初孵幼虫触角、足和口器等感受器官的形态与结构，因为成虫期这些感受器官发生退化，不能真实地反映蚧虫选择寄主过程中涉及的感受器官的形态特征［4］。蚧虫初孵幼虫为微小昆虫，体长不足1 mm，用解剖镜仅能观察清楚虫体轮廓如体形、体色、蜡丝等外部形态特征，采用扫描电镜观察，首先必须制作玻片观察清楚虫体的形态特征，再用扫描电镜进行重点形态结构分析。蚧虫初孵幼虫柔软、体被蜡丝，借用成虫制作方法容易引起虫体变形，借用其它微小昆虫(蚜虫)的制作方法不能完全除蜡，因此，探讨蚧虫初孵幼虫玻片制作技术依然具有重要的价值。笔者以白蜡虫初孵幼虫玻片标本制作为例，旨在提供蚧虫初孵幼虫的保存和玻片标本的制作方法，主要介绍新引入的虫体转移用具与使用方法，以供相关的研究人员参考与交流。

1 标本采集与保存

蚧虫成虫通常采用70%酒精保存，酒精容易引起虫体表皮皱缩，玻片标本主要适用表皮结构观察研究，而皱缩的表皮又会影响整体观察效果。白蜡虫初孵幼虫的保存引入植物材料常用的保存液FAA。由于初孵幼虫虫体柔软，FAA的配方为50%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福尔马林5 mL，并按固定液体积的5%加入甘油。FAA与酒精保存液差别在于加入冰醋酸提高了渗透速度，使虫体快速固定不变形，甘油软化硬化结构确保虫体不变形，并且FAA可以同时保存蚧虫及其寄主植物。一般采用FAA固定标本0.5～2.0 h，即可进入玻片制片阶段。

在野外用剪刀取有虫枝条或者叶片，若种虫周围有孵化的幼虫，直接用毛笔扫虫放入采集瓶;若种虫周围无孵化的幼虫，则取有虫寄主植物材料带回室内，放入培养皿(底垫光滑白纸)培养，待幼虫孵化，用毛笔扫入标本瓶。标本采集完毕，在标本瓶中加入虫体体积20～30倍的保存液。虫体固定一段时间后，更换保存液1～2次，室温保存可达数年。

2 玻片标本的制作

2.1 虫体转移工具

显微眼科镊子:由于虫体微小，用一般的镊子夹取极为困难，若采用显微眼科镊子(头宽0.1 cm)可以轻松将虫子移动。用吸管取虫虽操作方便，操作者不用训练就可以移动虫体，但吸管吸取虫体的同时常夹带其它杂质，用显微眼科镊子夹取虫体避免了吸管取虫的缺点。

转移虫袋:在制片过程中，操作者通常发现虫体经过KOH处理后，虫体几乎透明，用肉眼极难辨认，常规方法在虫体清洗、染色和脱水等过程中容易将虫体丢失，并且耗时，处理的标本数量较少。若采用转移虫袋，可避免常规制片出现的问题，既节省时间，还适用于批量制作，更重要的是避免了每个制片环节挪动虫体，较为完整地保存了虫体的细微结构特征。此外，转移虫袋减少制片过程中接触KOH、酒精、冰醋酸和二甲苯等溶液，使制片过程更为安全。转移虫袋采用200目以上的尼龙纱布制作，200目纱布孔径不超过74 μm。制作方法简单，将纱布裁剪为8 cm×4 cm方块，按图1所示虚线折叠，用昆虫针或曲别针扣边即可制作成转移虫袋(图2)。

图1 转移虫袋制作示意图

图2 转移虫袋

2.2 冰醋酸酒精混合脱水

在脱水过程中，采用常规的系列酒精溶液脱水，虫体出现硬化、破碎，不易获得完整的标本。若采用酒精和冰醋酸体积比1︰1的混合溶液进行脱水，虫体细微结构特征保存完好，并有利于整姿。酒精和冰醋酸的混合溶液设置70%、85%、95%、100%4个梯度，每个梯度用相应体积分数的酒精和冰醋酸混合配制而成。

2.3 Euparal封片

微小昆虫用中性树脂或加拿大树胶封片不容易整姿。用Euparal胶封片，可支持显微镜下缓慢地整理虫体附肢。此外，Euparal胶封存的标本更为平整和透明。

2.4 制作过程

①虫体软化与冲洗。用吸管吸取虫子，放入转移虫袋，挂上标签，将转移虫袋浸泡在10%KOH溶液中，30～40℃水浴;当虫体发白，立刻投入蒸馏水(60℃)冲洗3～5次，每次5 min。②系列冰醋酸酒精混合液脱水。将转移虫袋放入系列冰醋酸酒精混合溶液中脱水，每处理3～5 min;蒸馏水冲洗。③1%酸性品红染色。将冲洗完毕的转移虫袋，放入1%酸性品红染液中，染色时间控制在30～90 min;待肉眼观察到虫体发红即可。④100%冰醋酸酒精混合液清洗脱水。将染色的转移虫袋直接放入冰醋酸酒精体积比1∶1混合溶液洗脱1～2 min，重复2次。⑤丁香油透明。打开转移虫袋，用吸管吸取丁香油缓慢冲洗袋子将虫子洗脱于小培养皿或称量皿，透明处理2～3 h后，开始封片。⑥整姿封片。取载玻片，在玻片中央部位滴1滴Euparal胶。在解剖镜下，用显微眼科镊子夹取完整透明的虫体放在载玻片上，转移到100倍显微镜下，用超微针整理虫体足和触角，用一根超微针轻轻压住虫体，另一根针拨动附肢即可进行整姿。取盖玻片对准虫体接触Euparal胶后，立刻松开手指，使盖玻片自然沉降到虫体身上，注意不可挤压盖玻片，以免压碎虫体。按照该方法制作的白蜡虫初孵若虫玻片标本见图3。

图3 白蜡虫初孵若虫玻片标本

3 结论与讨论

白蜡虫初孵幼虫玻片制作与其它微小昆虫制片方法基本一致，仅在保存液、脱水溶液、封片剂以及转移工具和软化处理条件等方面进行了改进，因此，白蜡虫初孵幼虫玻片标本的制作方法同样适用于其它一些微小昆虫的玻片制作。

虫体软化是制作优质玻片的首要环节。用KOH软化虫子除内脏时，水浴温度不宜过高，控制在30℃为宜。当虫体发白时，立刻移入蒸馏水(60℃)清洗2～3次。对于体长小于0.5 mm的小型昆虫，用超微针穿刺虫体除内脏，即使在100倍解剖镜也很难准确定位穿刺部位。因此，微小昆虫除内脏建议用KOH稀溶液水浴溶解法。脱水是制片过程中重要的中间环节。采用冰醋酸或酒精单一脱水溶剂处理获得标本不完整。若将冰醋酸酒精对半混合脱水处理的标本较为完整。虫体整姿、封片是微小昆虫制片操作最为困难的环节。微小昆虫必须在高倍显微镜下进行整姿。整姿完毕后，用Euparal胶封片较少出现虫体皱缩和气泡。

在制片过程中，用转移工具转移虫体使得虫体的移动变得更为简便、快捷。通常采用挑虫环、挖耳和吸管等工具转移虫体［5－9］。挑虫环可能适用于相对较大的虫体，并且需要练习，否则在溶液中挑虫是困难的。吸管容易移动虫体，但同时夹带杂质。此外，微小昆虫通常将少量的虫体放在玻片上进行脱水、染色和透明，操作者眼睛必须随时盯住虫体，否则虫体在换溶液时易丢失。虫体软化后虫体外骨骼透明，操作者凭肉眼几乎无法辨认虫体位置。微小昆虫制片使用转移虫袋可以解决常规制片存在的问题。

玻片标本制作的安全性，逐渐受到了关注［6］。二甲苯透明标本具有速度快、透明性好的特点，其副作用也明显，建议使用丁香油代替二甲苯。昆虫表皮属于几丁质，以酸性品红对几丁质的染色效果突出，所以在昆虫玻片制作上应广泛使用酸性品红。对于酸性品红致癌性较少有人关注，酸性品红渗透速度快，在染色过程中必须戴手套。

总之，微小昆虫拟采用的制片方法必须确保获得的玻片标本清晰、洁净和完整，操作简单易行，对人体安全无毒副作用。

［1］Ben-Dov Y.A systematic catalogue of eight scale insect families(Hemiptera:Coccoidea)of the world Aclerdidae，Asterolecaniidae，Beesoniidae，arayonemidae， Conchaspididae， Dactylopiidae，Kerriidae and Lecanodiaspididae［M］.Amesterdam:Elsevier，2006.

［2］汤祊德.我国蚧虫研究的历史、现状和展望［J］.武夷科学，2001，17(1):82－86.

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［6］付海滨，王有福，王耀，等.植物检疫性蚧虫玻片标本制作技术［J］.植物检疫，2009，23(3):30－31.

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