响应面法优化大肠杆菌CD－2产偶氮还原酶培养基的条件1)

杜光映辉 崔岱宗 张 宁 赵 敏 李国芳 古晓旭

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

印染和染料工业是对环境污染极其严重的产业之一。我国年产染料为15万t［1］，偶氮染料产量占染料总产量的70%左右［2］，在偶氮染料的生产和使用中有10% ～15%的染料随废水排入水系中［3］，导致严重的水污染，引起了人们的广泛重视。偶氮染料是含有一个或多个偶氮键(—N=N—)的有机合成染色剂，目前广泛地应用于纺织、食品、药品等工业中［4］。然而，偶氮染料在水环境中可以长期稳定存在，更为严重的是大部分偶氮染料及其降解产物具有致畸、致癌、致突变的作用［5］。这些偶氮染料的降解产物如果长期蓄积并通过污染的水源和食物经口进入体内，会引起人类的各种疾病。因此，含偶氮染料的废水必须经过处理才能排到水系中［6］。目前处理含偶氮染料废水的工艺主要有物理法、化学法，如吸附、沉淀、化学氧化等，但由于这两种方法的低效和高成本，不能大规模应用到实际的污水处理中。生物法克服了这些缺点，在处理含偶氮染料废水中有明显的优势，已受到人们越来越多的关注［7－8］。生物法降解含偶氮染料废水的高效、环保和低成本优势使其具备了大规模应用的潜力。目前，对生物降解偶氮染料的研究主要集中在环境中各种微生物对偶氮染料的生物吸收和降解。近年来，能够在厌氧条件下高效降解偶氮染料的细菌，如Bacillus sp.、Klebsiella sp.等陆续被分离［9］出来，然而，厌氧条件下偶氮染料不能被完全降解，其生成的中间产物芳香胺类物质仍对环境有较大危害。所以有必要对偶氮染料在好氧条件下进行彻底降解的可能性进行深入研究。

笔者曾从中国海城市某纺织厂印染废水中发现并分离了一株能够在好氧条件下有效降解偶氮染料的细菌，经生理生化特性鉴定及16S rDNA基因序列分析确定为大肠杆菌，命名为E.coli CD－2，该菌能在好氧条件、较宽的温度、pH值和盐度范围下有效地降解多种偶氮染料。因此，菌株CD－2有巨大的潜力应用于含偶氮染料的废水处理中。本文通过前期试验对影响菌株CD－2的产偶氮还原酶培养基单因子条件进行了筛选和水平分析，并利用响应面法(RSM)对大肠杆菌CD－2的产偶氮还原酶培养基条件进行了优化，以提高大肠杆菌CD－2产偶氮还原酶的效率，为其能够进一步应用于偶氮废水处理打下坚实基础。

1 材料

菌种 研究所用菌株是从中国海城市某纺织厂印染废水中分离出来的，经生理生化特性鉴定及16S rDNA基因序列分析确定为大肠杆菌，命名为Escherichia coli CD－2。

培养基与试剂 富集培养基:Luria－Bertani(LB)培养基;单因子优化后的初始降解培养基:甘露醇 10 g·L－1、氯化铵 3 g·L－1、接菌量 2%、KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1、甲基红100 mg/L、pH 值为6.0;NADH 购自 Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

2 试验方法

菌种培养 接种Escherichia coli CD－2于100 mL LB培养基中，120 r/min，37℃培养12 h。以2%接种量接种到150 mL待优化的培养基中。120 r/min，37 ℃培养14 h。

偶氮还原酶粗酶液的提取 将上述培养过的菌液10000 r/min离心5 min后去上清收集菌体，用100 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)清洗两次，离心后用5 mL同样的磷酸缓冲液重悬菌体，用超声波破碎法(5 s，80%输出功率，50次破胞)对重悬液进行破胞处理。破碎完的重悬液10000 r/min离心15 min得到的上清即为粗酶液。

偶氮还原酶直接酶活的测定 2 mL酶活测定体系包括:0.2 mL 粗酶液、0.2 mol/L 染料、1.6 mL 100 mmol/L 磷酸缓冲液(pH=7.0)、0.2 mL 1 mmol/L的NADH，未加NADH前37℃温浴4 min，从加入NADH时开始计时，调至染料相应波长处测降解值，(经过全波长扫描，甲基红波长定为407 nm)一个酶活单位定义为:1 mL体系中1 min能降解1 mol染料所需要的酶量。

PB和响应面对产酶培养基进行优化 通过单因子试验对碳源、氮源、无机盐、pH和接菌量进行筛选，得出最佳碳源为甘露醇10 g·L－1，最佳氮源为氯化铵 5 g·L－1，最适无机盐为:KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1，最佳 pH 为 6，最佳接菌量为3%。以上述单因子试验得出的各个因子的最佳量为中心点取高水平和低水平，见表1，利用design expert 7.0软件中的 Plackett－Burman功能设计［10］并进行试验。

表1 Plackett－Burman试验设计各因子水平

最陡爬坡试验设计 响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分接近真实情况［13］，因此应该先逼近最大产酶区域后再建立有效的拟合方程。根据Plackett－Burman法筛选出的显著因子效应大小设计它们的步长，进行最陡爬坡试验，以寻找最大产酶区。其他因子选用Plackett－Burman试验中1和－1水平的最大值或最小值。本试验采用Plackett－Burman法的1/4步长进行设计。

响应面设计确定显著影响因子的最佳值 以最陡爬坡的结果作为响应面试验的中心点，利用软件design expert 7.0 中的 Box－Behnken［12］设计功能得出试验程序，进行试验，记录结果。利用Box－Behnken中的方差分析功能分析试验结果，以确定显著影响因子的最佳值。

3 结果与分析

3.1 Plackett－Burman设计筛选影响偶氮还原酶直接酶活的因子试验结果

对Plackett－Burman的结果进行方差分析，以P值小于0.1为标准选择3个显著因子:pH、MgCl2、Na2HPO4，根据3个因子的效应大小分别确定pH=5、MgCl2为 1.5 g·L－1、Na2HPO4为 8 g·L－1，作为最陡爬坡试验［11］的中心点，其他因子根据效应大小取最大值或最小值。

3.2 最陡爬坡试验结果

采用Plackett－Burman法的1/4步长进行最陡爬坡试验，试验结果如表3所示。由表3可知，在6次试验中，第2次试验产生的偶氮还原酶酶活最高，故选其作为响应面试验的中心点，即:MgCl2为1 g· L 、Na2HPO4为5 g·L 、pH值为6.0。

表2 Plackett－Burman试验结果

表3 最陡爬坡试验结果

3.3 响应面设计确定显著影响因子的最佳值

采用Box－Behnken设计响应面试验，其结果如表4所示。利用软件design expert 7.0对试验数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归方程为:Y(直接酶活)=2.09+0.028A+0.10B+0.51C－0.22A2－0.12B2－0.20C2－0.14AB+0.053AC+0.059BC，其中 A代表MgCl2，B代表Na2HPO4，C代表pH。

表4 Box－Behnken响应面试验结果

对回归方程进行方差分析，从响应面试验方差分析结果(表5)可以看出:一次项C的影响非常显著、B显著;二次项 A2、C2的影响非常显著、AB显著，其余项的影响不显著，故模型高度显著(P=0.0010＜0.050);回归模型的决定系数 R2=94.93%，表明其自变量与全体自变量之间的多元回归关系显著［14］;失拟项＞0.05，说明该回归方程具有较好的拟合度［15］，试验误差小。因此，可以用该回归方程对试验结果进行拟合分析和预测。

表5 响应面试验方差分析结果

由表6可知，试验结果与预测相符，说明响应面分析法分析和预测偶氮还原酶直接酶活的值是可靠的。

表6 试验结果的验证

由图1～图6可以看出，Na2HPO4和MgCl2、pH和MgCl2、pH 和 Na2HPO4对 Escherichia coli CD－2产偶氮还原酶酶活的交互作用都是显著的，这可以通过3个椭圆形的等高线图和另外3个较陡的立体曲面图清楚地看出来。从3个立体曲面图还可以看出，A、B和C都存在极值点。

图1 Na2HPO4和MgCl2交互作用对直接酶活影响的响应曲面图

图2 Na2HPO4和MgCl2交互作用对直接酶活影响的等高线图

图3 pH和MgCl2交互作用对直接酶活影响的响应曲面图

根据回归方程求一阶偏导得到Y的极大值，即在 MgCl2为 0.99 g·L－1、Na2HPO4为 6.00 g·L－1、pH=6.5时直接酶活达到最大，模型所预测的极大值酶活达到 2.451 U·mL－1。在 MgCl2为 0.99 g·L－1、Na2HPO4为 6.00 g·L－1、pH=6.5 条件下做 3次平行试验并取平均值，验证试验结果。由表6可知，试验结果与预测相符，说明用响应面分析法分析和预测偶氮还原酶直接酶活的值是可靠的，从而确定了最佳培养基的组成为:甘露醇2 g·L－1、氯化铵3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。优化后的酶活达到 2.429 U·mL－1，是初始酶活的2.85 倍。

图4 pH和MgCl2交互作用对直接酶活影响的等高线图

图5 pH和Na2HPO4交互作用对直接酶活影响的响应曲面图

图6 pH和Na2HPO4交互作用对直接酶活影响的等高线图

4 讨论

E.coli CD－2是一株能够降解偶氮染料、且在好氧条件下高效降解偶氮染料甲基红的菌株。通过本次试验，偶氮还原酶酶活提高的幅度较大。抑制酶活进一步提高的因子主要有空气中的氧气，它能将偶氮还原酶氧化。因此，可以在以后的试验中探索在粗酶液中添加抗氧化剂，如利用β－巯基乙醇来提高酶活。偶氮还原酶是胞内酶，在一定条件下，每次能够破碎细胞的数量一定。为了进一步提高破胞数量，从而提高酶活，有必要在以后的试验中优化破胞方法，如增加破胞次数、提高输出功率、将超声波破胞和低温反复冻融交替进行等方法。本试验中，响应面优化后酶活达到2.429 U·mL－1，比优化前提高了2.85倍，证明响应面分析法优化得到的偶氮还原酶酶活培养基条件是有效的。最佳培养基组成:甘露醇 2 g·L－1、氯化铵 3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。在最佳培养基条件下增强了 E.coli CD－2产偶氮还原酶的酶活，为今后应用于污水处理奠定了基础。

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