响应面法优化海洋枯草芽孢杆菌HS-A38增殖发酵培养基

张 欢，丛 丽 娜，侯 英 敏，王 丹，谢 三 群

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

枯草芽孢杆菌能够产生多种抗菌代谢产物［1］，其活菌被认为具有改善水生动物消化道和改良水环境的双重功效。枯草芽孢杆菌能简单地利用“竞争性抑制”即与病原菌竞争生存空间和营养，来实现对疾病的生物控制，是公认的具有水产养殖价值的益生菌［2］。本实验室从大连海域海参肠道中筛选得到一株枯草芽孢杆菌HS-A38，初步研究表明，该芽孢杆菌能显著抑制革兰氏阳性和阴性菌的生长，具有广谱的抗菌活性，尤其是对水产养殖中常见的副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌有较强的抑制作用。开发益生菌制剂，首先必须满足具有足够的活菌数量，这样方能作为优势菌群占据宿主的肠道，从而达到治疗和预防疾病的目的［3］。因此，为了将HS-A38芽孢杆菌开发成水产养殖益生菌制剂，需要提高发酵菌体的浓度水平，以降低生产成本，提高芽孢得率［4］。本研究以前期实验为基础，采用响应面法优化培养基组分，即首先应用Plackett-Burman析因实验确定对菌浓生长影响显著的因子，然后利用最陡爬坡实验趋近曲面的稳定点，最后根据中心组合实验（CCD）得到最佳培养基配比。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HS-A38：本实验室自行分离，16SrDNA 序列在GenBank的检索号为GQ 466597。

Zobell 2216E种子培养基：酵母膏1.0g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸铁250.0g/L，琼脂15～20g/L，pH 7.2～7.4。

发酵初始培养基：葡萄糖4.5g/L，豆粕粉13.50g/L，尿素0.6g/L，酵 母膏3.60g/L，K2HPO44.50g/L，ZnSO40.09g/L，pH 7.2～7.4。

Plackett-Burman实验、爬坡实验和中心组合实验的培养基：均采用实验所设计的配方［5］。实验结果通过Design expert 7.13实验设计软件［6］和Origin 7.50软件进行数据分析和绘图。

1.2 菌种活化与培养

种子液活化条件：一级活化挑取少量斜面菌种，接入容量为100mL、装液量为20mL 的种子培养基中，30 ℃、转速160r/min摇床培养12h。二级活化按5%的体积分数接入一级活化种子液、容量为250mL、装液量为50mL 的发酵初始培养基，并且按一级活化条件培养20h。

1.3 活菌计数

采用平板菌落计数法［7］，并针对本实验特点作部分改进。把发酵菌液按梯度稀释成10-5、10-6，分别取40和80μL涂布，放入30℃培养箱中过夜培养，待长出单菌落后数出每个平板上的菌落个数并记录，个数在30～300为有效值。以每毫升菌液中活细胞的个数计算得出的值为实验设计的响应值，其中，每毫升菌液中活细胞的个数（cfu/mL）=同一稀释度3 次重复的平均菌落数×稀释倍数×103/取样量。

1.4 菌株HS-A38的生长曲线

为确定取样的最佳时间，测得菌株HS-A38的生长曲线。配制发酵初始培养基，装液量均为20 mL，容量为100 mL的三角瓶，在30 ℃、160r/min摇床培养15h，然后每隔2h 取样，用平板计数法计数计算测出活菌浓度。以培养时间为横坐标、活菌数为纵坐标绘制生长曲线。

1.5 Plackett-Burman设计

采用Plackett-Burman实验设计，对影响菌株HS-A38 发酵菌体浓度的最佳组成，即葡萄糖（X1）、豆粕粉（X2）、尿素（X3）、酵母膏（X4）、K2HPO4（X5）、ZnSO4（X6）这6个因素进行全面考察。选用N=16，并且添加4个空余项用来估计 误差的P-B 设计［8］，实验结果 用Design expert 7.13软件进行数据分析。

1.6 最陡爬坡实验

通过Plackett-Burman 设计确定影响菌株HS-A38发酵浓度的显著性因素，然后通过各显著性因素的正负效应（相关系数ri）决定下一步最陡爬坡实验的爬坡路径（包括变化方向和变化的步长），以快速逼近曲面的稳定点区域［9］。

1.7 响应面实验设计

通过Plackett-Burman 实验确定影响菌株HS-A38发酵菌体浓度的主要因素，进而由最陡爬坡实验逼近影响菌体发酵浓度响应面稳定区域，并确定显著性因素的稳定点水平，探究该稳定区域的性质。为做到这一点，必须用一个至少二阶多项式去拟合该区域中适当配置的一组点位。用Design expert 7.13 软件对模型进行回归拟合得到二阶经验模型：

式中，Y为预测响应值即发酵活菌浓度，β为回归系数，X为因素水平。

1.8 活菌浓度测定

将二级活化的菌液按5%的体积分数接入相应的发酵培养基中（装液量均为20 mL，容量为100mL的三角瓶），在30 ℃、160r/min转速下培养到发酵平稳时期，取样并且按照“1.3”的方法计算得各设计组的活菌浓度。

2 结果与分析

2.1 菌株HS-A38的生长曲线

为了得到有效响应值，取样时间必须控制在发酵的平稳期。根据菌株HS-A38 的生长曲线（图1），将后续实验取样时间点设为培养23h后，以得到合理的响应值。

2.2 Plackett-Burman设计筛选影响菌体浓度的显著性因子

图1 HS-A38生长曲线Fig.1 Growth curve of the strain HS-A38

通过一系列单因素实验，确定葡萄糖、豆粕粉、尿素、酵母膏、K2HPO4和ZnSO4作为培养基的基本组成进行下一步实验，因为这6个因素对菌株HS-A38的发酵浓度的影响较大。每个因素的实验浓度按照高水平是低水平的1.25倍［10］取高低两个水平。Plackett-Burman实验设计和结果见表1，其中活菌浓度（Y）作为响应值（每组实验做3次平行，取平均值）。

采用Design expert 7.13软件对表1结果进行显著性分析。由表2可知，整个模型的来源可靠，对菌株HS-A38发酵菌体浓度有显著性影响（P＜0.05）的因素有葡萄糖和ZnSO4，其中葡萄糖有显著的正效应，ZnSO4有显著的负效应。因此，后续实验主要考察这两个因素，且适当增加葡萄糖，减少ZnSO4。

表1 Plackett-Burman实验设计和结果Tab.1 The results of Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman实验水平及回归模型方差分析Tab.2 The levels of Plackett-Burman and analysis of variance for regression model

2.3 最陡爬坡实验设计和结果

为了逼近影响发酵菌体浓度的稳定响应面区域，以建立有效的拟合方程，必须确定响应面区域中最大响应值处（稳定点）各个显著性因素水平的情况［11］。最陡爬坡实验是一种快速寻找稳定点的方法，首先根据Plackett-Burman 法筛选出的显著因子相关系数来设计它们的步长［5，11］，当设定葡萄糖步长ΔX1=1.5，计算得到ZnSO4步长ΔX6=-0.015；然后根据ΔX1、ΔX6设计X1、X6的变化路径（见表3），并将X2、X3、X4、X5的因素水平（g·L-1）固定（见表1中最大菌体浓度的第12组实验），配制不同组分的培养基，按照方法“1.8”测定设计组的发酵菌体浓度，实验响应值（Y）结果如表3所示。其中第（4）组实验因素对菌体发酵浓度的影响最大，响应变量接近最大响应区域，故选用该组因素水平临近范围的水平，即葡萄糖8.0g/L、ZnSO40.065g/L为稳定点进行响应面分析。

2.4 中心组合实验设计和结果

以葡萄糖和ZnSO4两个显著性因素为自变量，根据最陡爬坡实验得到的稳定点，将每个因素设置1、0、-1 三个水平（见表4）。响应面标绘在一个k（k=2）维的空间里，实验设计位点如图2所示，其设计中基本水平位点单位为+1和-1，原点O取在设计中点（0水平）；中心补充点位数目为（2k+1），即其中一个在中心处，其余的2k个成对的在坐标轴上分别配置在±a1，±a2，…，±ak处（a=1.414为轴线上的点位与中心的距离）。中心组合实验点位设计的结果见表5。

表3 爬坡路径的计算和实验结果Tab.3 The count and experience results of steepest ascent

表4 响应面设计的因素和水平Tab.4 Range of different factor invested in RSM

图2 两因素中心组合实验模型Fig.2 The modle of CCD design of two factors

表5 中心组合响应面实验设计Tab.5 CCD design and response value

根据表5设计表格配制不同培养基，按照方法“1.8”测得响应值Y。采用Design expert 7.13软件，选择显著性较高的模型做回归拟合，结果如表6所示。选择Quadratic模型（P＜0.001，R2=0.944 8，AdjustedR2=0.905 4），进一步由该软件直接得到影响HS-A38菌体发酵浓度的回归方程：

2.5 响应面分析和各组分最佳浓度的确定

利用Design expert 7.13软件对回归模型的可靠性进行分析。由表7可知，整个模型的P=0.000 3，失拟项不显著（Lack of fit=0.225 1），说明回归方程达到了较好的拟合程度。在此情况下，是显著性的，并且决定次数R2=0.944 8，说明在回归方程中自变量可以94.48%的解释因变量的结果。原因一方面是无法避免实验过程中的随机误差；另一方面，影响菌体浓度的因素很多，其他未被考虑的因素，比如各种培养条件，它们之间的交互作用可能引起结果的波动［11］。

表6 不同来源的模型参数结果Tab.6 The results of parameters from different models

表7 响应面实验方差分析结果Tab.7 ANOVA results of factors and model in the response surface experiment

再利用Design expert 7.13绘出响应面和对应的等高线图，如图3所示。由左图曲面可知曲面存在最高的点A，即响应值最大时所对应的曲面上的点，该点投影在等高线图上的点为A′，根据回归方程求一阶偏导得到X1=8.49，X6=0.053，预测值为1.64×109cfu/mL，在该条件下进行3次重复实验得到的平均值为1.61×109cfu/mL，这与模型基本吻合，说明设计合理，并且与初始发酵培养的发酵浓度相比提高了1倍多。

3 结论

通过响应面分析，确定了影响菌株HS-A38发酵菌体浓度显著性因素葡萄糖和ZnSO4质量浓度，并且建立了显著的回归方程，可用于生产预测。

发酵培养基优化后的最佳组成为葡萄糖8.49g/L，豆粕粉12.0g/L，尿素0.625g/L，酵母膏4.0g/L，K2HPO44.0g/L，ZnSO40.053g/L。优化后，发酵菌体浓度比优化前提高了1倍多，即从7.40×108cfu/mL提高到1.64×109cfu/mL。这为将菌株HS-A38开发成水产益生菌制剂奠定了基础。

图3 活菌数Y=f（X1，X6）响应面立体分析图及相应等高线图Fig.3 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X6）