HPLC－TOF/MS归属续断指纹图谱中的化学成分

刘云飞，季 德，张春凤，杨中林

(中国药科大学现代中药教育部重点实验室，江苏南京210009)

HPLC－TOF/MS归属续断指纹图谱中的化学成分

刘云飞，季 德，张春凤，杨中林*

(中国药科大学现代中药教育部重点实验室，江苏南京210009)

目的：对续断指纹图谱进行成分归属研究，为科学评价和有效控制其质量提供依据。方法：采用HPLCTOF/MS技术，通过正离子模式和负离子模式检测获得精确分子量，结合文献和对照品推测续断HPLC－TOF/MS指纹图谱中的化学组成。结果：采用HPLC－TOF/MS法推测了15个成分，用对照品确认了木通皂苷D、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、川续断皂苷V、川续断皂苷X、川续断皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元等8个成分。结论：该研究比较全面地阐明了续断的化学组成，使指纹图谱的特征性更强，为续断的鉴别与质量评定奠定了基础。

续断;HPLC－TOF/MS;指纹图谱;质量控制

续断为川续断科川续断属植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根。在《神农本草经》中被列为上品，具有丰富的药理活性［1］。

续断药材有效成分含量与气候、土壤等生态环境有关，不同来源的续断形态和化学组成相似，难以用形态学和简单的理化鉴定来区分。以往研究续断的指纹图谱，对续断中的化学成分的鉴定研究较少［2－4］。本文在前期研究续断HPLC指纹图谱的基础上［2］，采用了HPLC－TOF/MS和对照品确认两种方法，对续断指纹图谱中的化学成分进行研究，归属了23个成分，为评价续断质量进一步提供了科学依据。

1 仪器与试药

1100 HPLC(四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器，Agilent);高分辨质谱(Agilent);乙腈(色谱纯，Merck);水(乐百氏食品饮料有限公司);甲醇(分析纯，江苏汉邦化学试剂有限公司);乙醇(分析纯，上海化学试剂有限公司);甲酸(分析纯，ROE Scientific INC);木通皂苷 D(浙江省药检所，20041209);绿原酸(中国药品生物制品检定所，110753－200413);咖啡酸(上海试剂一厂，88－11－01);马钱苷、川续断皂苷V、川续断皂苷X、川续断皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元(自制，采用归一化法测得纯度均大于98%，光谱数据与文献报道一致［5－10］);续断药材(四川凉山产，经自我鉴定分别为川续断Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取续断药材粗粉2.5 g，置于50 mL烧瓶中，加入60%乙醇25 mL，浸泡1h，分别以25 mL、20 mL、20 mL的60%乙醇，各加热回流提取1次，时间分别为 90 min，60 min，30 min，合并 3 次续滤液，减压回收乙醇至无醇味，转移至50 mL容量瓶，用纯水定容至刻度，摇匀，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，即得 50 mg·mL－1的供试品溶液，用 200 μL 移液枪精密移取200 μL置1.5 mL的离心管内，再移取 200 μL 的纯净水，涡旋 30 s，即得 25 mg·mL－1的供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品(绿原酸、咖啡酸、马钱苷、川续断皂苷V、木通皂苷D、川续断皂苷X、川续断皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元)1 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成浓度0.1 mg·mL－1的对照品溶液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，备用。

2.3 HPLC色谱条件和HPLC－TOF/MS质谱条件研究

HPLC色谱条件参考文献［2］。在HPLC－TOF/MS质谱条件中，流动相水相更换为0.1%甲酸水溶液，进样量为 5 μL，其他色谱条件与文献［2］相同。离子扫描范围m/z 100～1800。电喷雾离子源条件如下：氮气流速：9.0 L·min－1;温度：320 ℃;喷雾器：35 psig;毛细管电压：3000 V。

采用正离子和负离子两种分析模式，检测到续断主要的分子离子峰有［M－H］－，［M+HCOO］－和［M+H］+3种形式。为了更直观的观察和识别峰的形态，选取了25 mg·mL－1和50 mg·mL－12 个浓度。在50 mg·mL－1浓度下，由于前5 min出峰的物质和木通皂苷D(标号为17)响应值较高会造成质谱响应过载，影响后续分析，此部分未进质谱仪，故在图1(B)中此段没有响应。

图 1 续断药材的总离子图谱(A：25 mg·mL－1，负离子模式;B：50 mg·mL－1，负离子模式;C：50 mg·mL－1，正离子模式)

2.4 HPLC－TOF/MS指纹图谱分析

按照文献［2］的色谱条件，建立续断HPLC指纹图谱和8个对照品的色谱图。以保留时间相近为原则，确认了绿原酸、咖啡酸、马钱苷、木通皂苷D、川续断皂苷X、川续断皂苷VII、川续断皂苷V和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元等8个成分，8个化合物的化学结构如图2，归属结果如表1所示。

图2 8个对照品的化学结构式

采用HPLC－TOF/MS获取23个化合物(标记如图1)的精确分子量，分析同一化合物在正、负离子两种模式下的离子形式(［M －H］－，［M+HCOO］－和［M+H］+)，确定每个化合物的分子量，结合从续断中分离得到的化合物，推测了15个成分，推测结果如表1所示。

3 讨论

由于续断中各化学成分的含量差异较大，为了使含量低的化合物也能在谱图中显示，本实验选取了25 mg·mL－1和50 mg·mL－1两个浓度。从图 1 中可以看出，在负离子模式下，当供试品溶液浓度为50 mg·mL－1时，前90 min谱图峰形较好且分离度较高(图1(B));当供试品溶液浓度为25 mg·mL－1时，90 min后各峰响应值适宜如图1(A)。续断中化学成分主要由皂苷、环烯醚萜和黄酮类等化合物组成［1］，这些化合物在负离子模式下，更容易检测到［M－H］－和［M+HCOO］－离子，所以图1中(A，B)中各个峰响应值较高。采用负离子模式得到的续断HPLC－TOF/MS指纹图谱各峰分离的较好，故续断HPLC－TOF/MS指纹图谱采用负离子模式检测较为适宜，是目前研究续断指纹图谱较为完善的分析方法。

前期对续断HPLC指纹图谱研究缺乏成分的归属［2］，故本论文采用HPLC－TOF/MS技术结合对照品对续断HPLC指纹图谱中的色谱峰进行指认。结合HPLC－TOF/MS图谱信息和续断的文献报道，在HPLC－TOF/MS图谱中初步指认了23个化合物。但上述23个化合物的指认是推测结果，我们进一步采用对照品进行了确认，因为对照品有限，目前我们只确认出其中的8个化合物，较文献报道的指纹图谱增加了5个化合物的确认［14］，使续断指纹图谱特征性更强，给续断的质量控制研究提供了更多实验依据和参考。

表1 续断中化学成分的推测结果

［1］ Zhao Y M，Shi Y P.Phytochemicals and Biological Activities of Dipsacus Species［J］.Chem Biodivers，2010，8：414 －430.

［2］ 刘凤乐，杨中林，刘云飞，等.续断药材的HPLC指纹图谱研究［J］.中医药学报，2009，37(5)：62－65.

［3］ 曹越，彭维，苏薇薇，等.续断药材指纹图谱的研究［J］.中药新药与临床药理，2010，21(1)：51－54.

［4］ 杨明利，王秀军，陈秋实.续断的指纹图谱研究［J］.武汉生物工程学院学报，2009，3(5)：181－184.

［5］ Papalexandrou A，Magiatis P，Perdetzoglou D，et al.Iridoids from Scabiosa variifolia(Dipsacaceae)growing in Greece［J］.Biochem Syst Ecol，2003，31(1)：91 －93.

［6］ 张永文，薛智.川续断中的新三萜皂苷［J］.药学学报，1991，26(12)：911－917.

［7］ 张永文，薛智.川续断中皂苷IX和X的结构研究［J］.药学学报，1992，27(12)：912－917.

［8］ Kouno I，Tsuboi A，Nanri M，Kawano N.Acylated triterpene glycoside from roots of Dipsacus asper［J］.Phytochemistry，1990，29(1)：338－339.

［9］ 张永文，薛智.川续断的化学成分研究［J］.药学学报，1991，26(9)：676－681.

［10］ Zemtsova G N，Bandyukova V A，Shinkarenko A L.C－Glycosides of Dipsacaceae species［J］.Him Prir Soedin，1972(5)：678.

［11］ Hung T M，Na M K，Thuong P T，et al.Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall［J］.J Ethnopharmacol，2006，108(2)：188 －192.

［12］ 田小雁.四种中草药的活性成分研究［D］.北京：中国协和医科大学，2006.

［13］ Jensen S R，Lyse－Petersen S E，Nielsen BJ.Novel bis－iridoid Glucosides from Dipsacus sylvestris［J］.Phytochemistry，1979，18(2)：273－277.

［14］ 韦英杰，贾晓斌，樊宏伟，等.续断的色谱指纹及LC－ESIMS分析［J］.中国中药杂志，2011，36(2)：169 －174.

Identification of the Constituents of Dipsacus asperoides by HPLC－TOF/MS

Liu Yunfei，Ji De，Zhang Chunfeng，Yang Zhonglin*
(Key Laboratory of Modern Chinese Medicines，Ministry of Education，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009 China)

Objective：Research was performed on HPLC－TOF/MS fingerprint to identify compounds in Dipsacus asperoides.Method：The accurate mass was obtained by HPLC －TOF/MS in both positive and negative ion modes.Combined with literatures components were concluded in D.asperoides by chemical substances.Results：Fifteen components were concluded and eight(chlorogenic acid，asperosaponin VI，loganin，akebia saponin X，akebia saponin VII，akebia saponin V and 3－O－α－L－arabinopyranosyl－hederagenin)were identified by comparing with standard substances.Conclusion：This study gave more details of chemical constituents of D.asperoides，which made fingerprint more characteristic.HPLC－TOF/MS technique could be used in quality control of D.asperoides.

Dipsacus asperoides;HPLC－TOF/MS;fingerprint;quality control

R917

A

1006－9690(2012)03－0022－04

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.03.007

2011－12－11

国家自然科学基金重点课题(中药盐制与咸入肾、肾主骨相关性研究，30730113)和江苏省高校优势学科建设工程资助项目

刘云飞(1985－)，男，硕士，主要从事中药质量控制研究。

*通讯作者：杨中林。E －mail：yzl1950@yahoo.com.cn