正交设计优化金樱子多糖的酶提取工艺

文全泰潘廷啟颜祖弟肖林彬张照平黄锁义

（1右江民族医学院临床学院，广西 百色 533000；2右江民族医学院基础学院；3右江民族医学院药学系）

正交设计优化金樱子多糖的酶提取工艺

文全泰1潘廷啟1颜祖弟2肖林彬1张照平2黄锁义3

（1右江民族医学院临床学院，广西 百色 533000；2右江民族医学院基础学院；3右江民族医学院药学系）

目的：确定金樱子多糖的最佳酶提取工艺。方法：利用纤维素酶从金樱子中提取多糖，采用正交试验设计进行条件优选，通过分光光度法对提取物进行多糖含量的测定。结果：检测波长为490 nm，葡萄糖含量在0.010～0.100 mg/m L范围内呈良好的线性关系（r=0.999 2），最佳酶提取工艺为pH=6，酶用量为6.0 m L，反应温度为60℃，酶解时间为2.0 h。在此条件下，金樱子多糖的平均提取率为24.48%，RSD=1.47%。结论：优选出的酶提取工艺合理、经济、可行。

金樱子；多糖；纤维素酶；正交设计

金樱子为蔷薇科植物金樱子（Rosa laevigata M ichx.）的干燥成熟果实。《本草纲目》记载金樱子“性酸、涩、平，无毒；主治脾泻下痢，止小便利，涩精气；久服，令人耐寒轻身，补血益精，有奇效。”[1]研究表明，金樱子果实中富含的金樱子多糖、黄酮等物质具有抗氧化、抗炎、提高机体免疫力等作用[2-4]，可广泛应用于医药及保健食品领域，市场前景广阔，因此有效提取金樱子多糖具有重要意义。

多糖是由单糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是一切生命有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关[5]。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂多样的生物活性和功能，如免疫调节、抗肿瘤、延缓衰老、降血脂、抗血栓作用等[6]，因而越来越引起人们的关注。测定可溶性糖的含量可采用蒽酮比色法[7]、二硝基水杨酸法[8]、苯酚 -硫酸法[9]等。苯酚 -硫酸法操作简便，重现性好，不要求特殊条件，几乎可用于任何糖类及其衍生物的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），电子分析天平 FA1104（上海天平仪器厂），植物粉碎机 FZ102（上海锐丰仪器仪表有限公司），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），电热式恒温水浴锅HHS-21-4（江苏金坛宏凯仪器厂），80-2离心沉淀器 （江苏省金坛市医疗仪器厂），722（N）可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试药

金樱子（购自百色市右江区，由右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定）；纤维素酶(活力40 000 U/g)；苯酚、浓硫酸、葡萄糖、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 纤维素酶悬浮液的制备

精密称取纤维素酶2.500 g，用蒸馏水定容至1 000 m L（100 U/m L）放入冰箱待用，用前摇匀。

2.2 金樱子多糖待测液的制备

将干燥的金樱子在植物粉碎机上粉碎，制成金樱子干粉。根据实验按需称取1.000 g金樱子干粉若干份，加缓冲溶液及不同体积的酶悬浮液，缓冲液及酶悬浮液的总体积为20.0 m L，分别在不同pH值、酶用量、酶解温度和提取时间等单因素条件下进行提取实验。将提取液过滤后定容，取上液适量稀释一定的倍数，待测。根据单因素实验结果，以多糖的含量为实验指标，进行L9（34）正交试验。

2.3 金樱子多糖的纯化

准确称取金樱子干粉5.000 g，按最优工艺提取，得多糖粗提液。粗提液减压浓缩至10～20m L后离心，上清液加入5倍的无水乙醇醇沉，置冰箱中4℃过夜，收集沉淀，沉淀再依次用 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，干燥得金樱子粗多糖，沉淀物于热蒸馏水复溶，使用Sevag法[10]多次脱蛋白，再用活性炭（粉末）回流 1 h，脱色，过滤，离心，得上清液。上清液浓缩，用无水乙醇调节滤液的醇浓度为80%，置冰箱中4℃沉淀过夜，抽滤收集沉淀，沉淀再用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 3次，干燥得精制多糖。

2.4 金樱子多糖提取率的检测

本实验对多糖的测定采用苯酚-硫酸法。取待测液0.5m L置于10.0m L的试管中，加入5%的苯酚溶液1.0 m L，混匀，迅速加入5.0 m L的浓硫酸，摇匀，40℃水浴中反应30 m in，然后置于冷水中冷却10 min，以葡萄糖为标样，于波长490 nm处测定吸光度值。由一元线性回归方程推算出金樱子多糖的质量。

2.5 换算因子测定

称取金樱子精制多糖约50 mg，精密称定，置100 m L容量瓶中，加少量蒸馏水溶解并稀释至刻度。精密吸取5.0 m L，定容至50.0 m L，按1.2.4中方法测定吸光度，按下式计算：

换算因子f=W/CD，

W 为多糖质量（mg），C为多糖中葡萄糖的浓度（mg/m L），D为多糖的稀释因素。测得f=0.775 2。

2.6 多糖含量测定

精密吸取待测液，按 2.4中方法测定吸光度值，按回归方程求出待测液中葡萄糖含量，按下式计算样品中多糖含量：

多糖含量（%）=CDf/W×100，

式中C为供试液葡萄糖浓度 (mg/m L)，D为供试液的稀释因素，f为换算因子，W为供试品质量（mg）。

2.7 标准曲线的绘制

称取干燥（105℃）至恒重的葡萄糖约50 mg，精密称定，加蒸馏水定容至100 m L，得标准葡萄糖溶液。取标准葡萄糖溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 m L，分别定容至 50 m L，得不同浓度的稀释液。分别精密吸取上述稀释液0.5 m L按1.2.4中方法显色，测定吸光度值，以吸光度值（A）对质量浓度C（mg／m L）进行回归，得回归方程：

表明对照品葡萄糖含量在0.010～0.100mg/m L范围内与对应吸光度值有良好线性关系。

2.8 正交实验

经预实验研究发现，对金樱子多糖的提取有影响的主要因素有pH值、酶用量、酶解温度、酶解时间。因此采用L9（34）正交试验表进行正交试验设计，因素水平见表1，并以金樱子多糖的含量为评价指标，计算得到最佳工艺条件（见表2），方差分析见表3。

表1 正交因素水平

表2 L9（34）正交实验及结果

表3 方差分析

根据试验结果及方差分析可知，各因素对酶法提取金樱子多糖的影响大小顺序为A＞B＞C＞D，即pH值的影响最大，酶解时间的影响最小，从省时的角度考虑，确定金樱子多糖酶辅助提取的最优条件为 A2B3C2D2，即 pH值为 6，酶用量为6.0 m L，反应温度为60℃，酶解时间为2.0 h。

2.9 验证试验

取金樱子 3份，每份 1.000 g，按优选出的工艺进行提取，即pH值为6，酶用量为6.0 m L反应温度为60℃，酶解时间为2.0 h，结果见表4。

表4 验证试验结果 （%）

按最佳提取条件进行提取，多糖提取率平均为24.48%，RSD为1.47%，结果与正交试验中的8号试验多糖提取率相近且高于8号试验，因此得出的结果是可靠的，且工艺稳定可行。

3 结论

研究表明金樱子中含有多糖、黄酮类物质、三萜类及其衍生物等成分[11]，而大多数中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内；而纤维素是由 β-D-葡萄糖以 1，4-β-葡萄糖苷键连接，纤维素酶酶解可以促进β-D-葡萄糖苷键的裂解，使植物细胞壁被破坏，有利于植物有效成分的浸出，还能促进残留半乳甘露聚糖主链（1，4-β-葡萄糖苷键连接）的降解，降低提取液的黏度，而提高金樱子多糖的提取率。

本实验通过单因素试验和正交试验法，旨在优化金樱子多糖的酶解提取工艺，得出最佳酶解提取工艺为pH值为6，酶用量为6.0 m L，反应温度为60℃，酶解时间为2.0 h。并在此条件下，金樱子多糖的最佳提取率为19.62%。而酶法提取金樱子多糖操作简单，节省成本，提取效率高，极大地缩短了提取周期，具有合理、经济、可行的优点，因而应用前景比较广阔。

[1]李时珍.本草纲目 （下册）[M].北京：人民卫生山版社，1978：2069-2097.

[2]张庭延，聂刘旺，刘爱民，等.金樱子多糖的免疫活性研究[J].中国实验方剂学杂志，2005，11（4）：55-58.

[3]张庭廷，潘继红，聂刘旺，等.金樱子多糖的抑菌和抗炎作用研究[J].生物学杂志，2005，22（2）：41-42.

[4]赵云涛，国兴明，李付振，等.金樱子多糖的抗氧化作用[J].云南中医中药杂志，2003，24（4）：35-37.

[5]陈永亮，蔡建琦，李丽，等.微波法提取旋覆花多糖工艺研究[J].甘肃科技，2006，22（5）：147-149.

[6]刘婷，周光明.多糖的提取和分析方法[J].化工时刊，2008，22（3）：66-70.

[7]罗千古，吴俊标，周玖瑶，等.灵芝膏中多糖含量测定[J].中国医药导报，2011，8（3）：56-57.

[8]林志銮，刘俊劭.3，5-二硝基水杨酸法测定金钱草多糖的研究[J].云南民族大学学报，2011，20（2）：89-91.

[9]钟方晓，任海华，李岩.多糖含量测定方法比较[J].时珍国医国药，2007,18（8）：1916-1917.

[10]王建壮，安洁，吕华冲.植物多糖含量测定的方法学研究[J].海峡药学，2008，20（5）：59-60.

[11]肖凯军，刘晓红.金樱子果实的化学成分及其应用[J].现代食品与药品杂志，2006，16（4）：1-3.

Orthogonal Design for Optim ization of Enzyme Extracting Procedure of Polysaccharides from Rosa laevigata

Wen Quantai1，Pan Tingqi1，Yan Zudi2，Xiao Linbin1，Zhang Zhaoping2，Huang Suoyi3（1 Department of Clinical Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；2 Department of Basic Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities；3 Department of Pharmacy of Youjiang Medical University for Nationalities）

Objective:To determ ine the optimized enzyme extracting procedure for the extraction of polysaccharides from rosa laevigata.M ethods:For the cellulase extraction of polysaccharides from rosa laevigata，orthogonal test design was used for the condition optim ization and spectrophotometric method was employed for the determ ination of polysaccharide content of extract.Results:The wavelength of the maximum absorption was at 490 nm.A good linear relationship of glucose concentration was w ithin the range of 0.010～0.100 mg/m L（r=0.999 2）.The optimum technological conditions for the extraction were as follows:pH was 6，amount of enzyme was 6 m L，the reaction temperaturewas at60℃and enzymatic hydrolysis timewas 2.0 h.Under these conditions，themean extraction ratewas 24.48%，（RSD=1.47%）.Conclusion:The optim ized enzyme extracting procedurewas reasonable，economic and feasible.

Rosa laevigata；Polysaccharide；Cellulase；Orthogonal Design

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.11.008

右江民族医学院民族医药协会资助项目（20120516）

2012-03-06）

文全泰，男，本科在读。研究方向：中药有效成分提取。E-mail：wenquantai521@163.com

黄锁义，男，教授，硕士生导师。研究方向：天然产物化学、药物化学、食品卫生。通讯作者E-mail：huangsuoyi@163.com

更正：本刊2012年第7期（总第103期）第27页表1中C省三级医院总数“37”更正为“35”，C省三级医院抽样数量“37”更正为“35”。