HPLC测定壮骨冲剂中补骨脂素的含量

陈良胜

（河南新县人民医院，河南 信阳465550）

HPLC测定壮骨冲剂中补骨脂素的含量

陈良胜

（河南新县人民医院，河南 信阳465550）

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）壮骨冲剂补骨脂素含量测定的方法。方法：Hypersil BDS C18色谱柱（4.6mm×200mm，5μm），流速1.2m L/m in，流动相：甲醇-水（40∶60），进样量10μL，理论板数不低于3 000（按补骨脂素峰计），柱温30℃，检测波长246 nm。结果：补骨脂素在0.201 8～0.706 4μg范围内呈良好线性（r=0.999 7），平均回收率为102.57%，RSD=1.93%。结论：该方法准确可靠、简便、快速、重复性好。

壮骨关节丸是治疗退行性骨关节病常用中药复方制剂。近年来涉及壮骨关节丸的药品不良反应（ADR）报告数量呈增长趋势。ADR表现主要为皮疹、瘙痒，恶心、呕吐、腹痛、腹泻、胃痛，血压升高，肝功能异常，其中肝损害表现最为多见。为此，本院临床医师、药师以及相关制剂人员对壮骨关节丸的处方和制备工艺进行改进，研制出壮骨冲剂，院内协定处方包括狗脊、淫羊藿、骨碎补、续断、补骨脂、桑寄生、鸡血藤、当归、木香、乳香、没药，具有补益肝肾、养血活血、舒筋活络、理气止痛的功效。用于肝肾不足、血瘀气滞、脉络痹阻所致的骨性关节炎、腰肌劳损，症见关节肿胀、疼痛、麻木、活动受限等[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMateTM3000型智能液相色谱仪（美国戴安公司）；AE240型电子分析天平（Mettler公司）；超声清洗器（重庆洁美达超声波）；SPD-6AV紫外检测器（日本岛津公司）。

1.2 试药

补骨脂素对照品（原中国药品生物制品检定所，批号 0739-201007）；壮骨冲剂（本院制剂室），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：

色谱柱：依利特 Hypersil BDS C18（4.6 mm× 200 mm，5μm），流速：1.2 m L/m in，流动相：甲醇-水（40∶60），进样量：10μL；理论板数不低于3 000（按补骨脂素峰计）。

2.2 检测波长的确定

将补骨脂素对照品溶于流动相中，测定其紫外吸收光谱，测得最大吸收波长为246 nm，因此确定检测波长为246 nm。供试品、对照品及空白对照色谱分别见图1。

图1 补骨脂素对照品、供试品及空白对照HPLC

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品的制备 精密称取在60℃真空干燥4 h的补骨脂素对照品，加甲醇制成每1 m L含25μg补骨脂素的溶液，即得。

2.3.2 供试品的制备 取壮骨冲剂样品约5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 m L，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40 kHz）30 m in，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 提取条件的选择

2.4.1 提取方法的考察 经文献检索[2-4]，补骨脂素在甲醇、乙酸乙酯中的溶解性较好，分别采用超声和回流方法，比较2种溶剂对补骨脂素提取率的影响。

2.4.1.1 乙酸乙酯回流/超声提取 取壮骨冲剂样品约 5 g，研细，精密称定，用乙酸乙酯回流或超声提取4次，每次40 m L，每次30 m in。分别将每次提取液滤过，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至50 m L容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，进样。

2.4.1.2 甲醇回流/超声提取 取壮骨冲剂样品约5 g，研细，精密称定，用甲醇回流或超声提取4次，每次40 m L，每次30 m in。分别将每次提取液滤过，蒸干，残渣用适量甲醇溶解后，分别定量转移至50 m L容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，进样。结果见表1。

表1 不同提取方法对补骨脂素提取率的影响

结果显示，乙酸乙酯超声和回流对补骨脂素的提取效果较差，甲醇超声和回流结果相当，选择方法较简单的甲醇超声提取补骨脂素。

2.4.2 提取溶剂及用量的考察[5-7]壮骨冲剂样品（批号1002011），经甲醇超声提取4次，补骨脂素基本提取完全，含量为0.412 0 mg/g。甲醇超声提取4次，方法较繁琐，考虑加大溶剂用量，超声提取1次。称取两份样品，分别考察提取溶剂甲醇用量为80、100、120 m L，超声处理 30 min，对补骨脂素提取率的影响。取本品约5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量的甲醇，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见表2。

表2 甲醇用量对超声处理条件下补骨脂素提取率的影响

结果显示，提取溶剂为100 m L，超声30 m in，补骨脂素的提取率约92%，补骨脂素基本提取完全，满足含量测定要求，确定提取溶剂用量为100m L，提取次数为1次，超声时间为30 m in。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密称取补骨脂素对照品5.046 mg，置10 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。分别精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L分别置10 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10μL于注入液相色谱仪，测定其峰面积。以峰面积值积分值（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：

结果表明，在0.201 8～ 0.706 4μg范围内，补骨脂素对照品和峰面积呈良好线性关系。

2.5.2 精密度试验 精密量取对照品溶液，照含量测定方法连续进样6次，测定补骨脂素峰面积积分平均值为22.831 6，RSD=0.67%，说明精密度良好。

2.5.3 重复性试验 按拟定的含量测定方法，取同一批样品（批号：1002011），分别按 2.3.2项下操作，制备6份供试品溶液，测定补骨脂素的含量，分别为0.375 5、0.377 0、0.381 5、0.369 0、0.373 5、0.363 8 mg/g。结果，补骨脂素含量平均值为0.373 4 mg/g，RSD=1.67%，表明重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密称取含量的同一批号（批号：1002031，含量0.373 4mg/g）的样品2.5 g，分别精密加入0.100 1 mg/m L补骨脂素对照品溶液各10 m L，再精密加入甲醇90 m L，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40 kHz）30 m in，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。计算补骨脂素总量，并由下列公式计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

回收率（%）=（测出补骨脂素总量－供试品中补骨脂素的含量）/加入补骨脂素的量×100%

结果显示，本方法准确度良好。

2.5.5 稳定性试验[9-10]精密吸取供试品溶液（批号：1002011）分别在 0、2、4、6、8、10、12 h进样，记录峰面积，结果补骨脂素峰面积的RSD=1.04%，表明供试品溶液12 h内基本稳定。

3 样品含量测定

取10批样品，按上述方法测定其补骨脂素的含量，每批样品制备6份，每份重复进样2次，测定结果见表4。

表4 补骨脂素含量测定结果

4 结论

本研究采用HPLC测定壮骨冲剂中补骨脂素的含量，该方法准确可靠，简便、快速、重复性好。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]卢仁宣.HPLC测定益肾灵颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].广西中医药，2009，32（5）：60-62.

[3]刘畅，柴逸峰，朱臻宇，等.高效液相色谱法同时测定荷丹片中荷叶碱丹参酮A补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].解放军药学学报，2011，27（1）：57-59.

[4]徐梅，邵珠民，吕冬梅，等.反相高效液相色谱法测定补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].徐州医学院学报，2008，28（8）：543-545.

[5]杨静，谭沛，潘桂湘，等.HPLC法同时测定壮骨关节丸中3种有效成分的含量[J].广东药学院学报，2009，（5）：356-367.

[6]崔俊凤，傅勇.RP-HPLC法测定益肾灵颗粒中淫羊藿苷的含量[J].广东药学，2005，19（9）：546-548.

[7]裴世柱，尹程鑫，花勇.HPLC法测定消斑颗粒中补骨脂素、异补骨脂素含量[J].辽宁化工，2008，32（1）：62-64.

[8]邓亚利，周莉玲.HPLC测定血宝片中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中成药，2008，30（2）：278-280.

[9]高岚，邹中胜.HPLC法测定骨康片中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].现代中药研究与实践，2008，22（2）：45-47.

[10]颜仁梁，刘志刚，罗佳波.HPLC测定益肾补血胶囊中异补骨脂素含量[J].中国中医药现代远程教育，2008，6（11）：1329-1331.

The Content Determ ination of Psoralen in Zhuanggu Electuary by HPLC

Chen Liangsheng(The People’s Hospital of Xin County of Henan Province,Henan Xinyang 465550,China)

Objective:To establish a method for the content determ ination of psoralen in zhuanggu electuary by HPLC.M ethods:The Hypersil BDS C18chromatographic column（4.6 mm×200 mm，5μm）was used.The flow rate was 1.2 m L/m in，the mobile phase wasmethanol-water （40∶60），the sample size was 10μL，the theoretical plate number was not less than 3 000 (according to psoralen peak meter)，the column temperature was at 30℃，and the detection wavelength was at 246 nm.Results:There was a good linear relationship w ithin the range of 0.201 8～0.706 4μg for psoralen（r=0.999 7）.The average recovery was 102.57% (RSD=1.93%).Conclusion:This method was proved accurate，reliable，simple and fastw ith a good repeatability.

HPLC；Zhuanggu Electuary；Psoralen；Content Determ ination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.11.009

2011-12-21）

陈良胜，男，主管药师。研究方向：医院药学。E-mail：wpcy56@tom.com

【关鍵词】 高效液相色谱法；壮骨冲剂；补骨脂素；含量测定