黑线仓鼠及其白化突变系TYR、TYRP1的基因表达水平比较分析

赵彦斌，孙兆增，白杰英，张小飞，李爱学，柳巨雄，隋丽华，胡仲明，曾 林

(1.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071;2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062)

黑线仓鼠及其白化突变系TYR、TYRP1的基因表达水平比较分析

赵彦斌1，孙兆增1，白杰英1，张小飞1，李爱学1，柳巨雄2，隋丽华1，胡仲明1，曾 林1

(1.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071;2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062)

目的 本研究旨在研究TYR、TYRP1基因在黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中的表达情况，探索其与白化毛色性状的产生是否具有相关性。方法 以黑线仓鼠和白化突变系皮肤组织为研究对象，采用实时荧光定量 PCR技术，分别得到黑线仓鼠与白化突变系TYR和TYRP1基因的相对表达量。结果 黑线仓鼠皮肤中的TYR和TYRP1基因的mRNA相对表达量分别是白化突变系皮肤组织中的2.5倍和5.3倍。结论 表明黑线仓鼠皮肤中TYR、TYRP1的基因表达水平存在表达差异，白化突变系 TYR、TYRP1基因发生表达下调，揭示出了 TYR、TYRP1基因的表达量与白化突变系白化性状的产生有关。

白化突变系;TYR;TYRP1;实时荧光定量 PCR

毛发与皮肤中黑色素的数目、种类与分布的差异使哺乳动物产生不同的毛色［1］。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein，TYRP1)都属于黑色素细胞家族的成员，调控黑色素的合成过程。酪氨酸酶(TYR)对哺乳动物各种不同毛色的产生至关重要，因此 TYR基因也往往成为研究动物不同毛色表型的热点基因［2－3］。人、小鼠、大鼠等物种的酪氨酸酶基因位点结构和功能已得到深入的研究，TYR是黑色素形成的关键酶也是限速酶之一，它的表达活性决定着黑色素合成的数目及速度，小鼠TYR基因被定位在白化位点上，它的突变往往会导致黑色素的合成受阻，因此该基因的克隆多被用于研究白化病等色素缺失性疾病［4］。TYRP1基因是首先被克隆得到的一种色素基因，TYRP1基因编码二羟基吲哚羧酸氧化酶，在黑色素合成的下游途径发挥作用，它定位于小鼠的brown位点。了解这些调控黑色素生成相关基因的结构和表达规律，有助于阐明色素形成的机制。近些年已有研究者进行过TYR、TYRP1基因突变与不同毛色产生的关系的研究［5－6］，但是关于不同毛色表型的产生与TYR、TYRP1表达量变化是否具有相关性的研究报道较为匮乏。

黑线仓鼠白化突变系是培育形成的一种新实验动物品系，但目前对其白化性状产生的机制还缺乏深入的研究，鉴于 TYR、TYRP1在黑色素合成中的重要作用，本研究将对 TYR、TYRP1基因的研究作为明确黑线仓鼠产生白化性状原因的出发点，本实验采用实时荧光定量PCR技术(QRT－PCR)首次研究TYR、TYRP1在黑线仓鼠与其白化突变系皮肤组织中mRNA的表达量，比较其表达量的差异，以明确TYR、TYRP1的基因表达量与白化性状产生的相关性，为最终揭示黑线仓鼠白化突变系白化性状的产生机理奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

黑线仓鼠及其白化突变系，体重20～22 g，雌雄各8只，8周龄。购自军事医学科学院实验动物中心［SCXK－(军)2007－004］，实验动物使用合格证号:［SYXK－(军)2007－005］。

1.2 仪器和材料

Trizol(Invitrogen);DEPC(Promega);反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)、SYBR Premix Ex TaqTMII、pMD18－T 载体购自TaKaRa公司;DNA Marker2000(康为世纪);凝胶回收试剂盒(BioFlux);Real Time PCR 扩增仪 (BIO－RAD iQTM5).

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取及 RT－PCR:

使用 Trizol一步法提取黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织总 RNA，电泳检测其完整性，并使用ND2100微量核酸蛋白测定仪测定核酸浓度和纯度。

将各皮肤样本总RNA稀释为相同的浓度，反转录反应体系:5× PrimeScriptTMBuffer 4 μL，PimeScript RT Enzyme Mix 1.0 μL，Oligo(dT)Primer1.0 μL，随机引物 1.0 μL ，Total RNA 2 μL，DEPC 水加至20 μL。反应条件:37℃ 30 min，85℃7 s;4℃保存。以特异引物进行目的基因 PCR扩增，克隆后测序鉴定。

1.3.2 合成引物:

根据前期实验已克隆测序得到的黑线仓鼠TYR与TYRP1序列设计引物，并且通过Blast初步检测引物的特异性。TYR基因上下游引物序列分别 为:5＇－GTAAGTTTGGATTTGGGGG－3＇和5＇－ATATGTGCCTGTGGGGATG－3＇，扩增产物长度为204 bp;TYRP1基因上下游引物序列分别为:5＇－CAGGTTTGGGCTCAGTTTCC－3＇和 5＇－CGGTCATC TTTACCATCGTG－3＇，扩增产物长度为 190 bp;内参基因β－actin上下游引物序列 分 别 为:5＇－AGTGTCCCAACATCCCAGC－3＇和 5＇－GTGACACCGT CCCCAGAAT－3＇，扩增产物长度为 194 bp。

1.3.3 QRT－PCR:

标准曲线:以黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织的cDNA为模板，按照3倍梯度稀释5个浓度标准，进行QRT－PCR扩增，扩增体系:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各 0.6 μL，cDNA 模板2 μL，灭菌蒸馏水加至25 μL。扩增反应条件:95℃预变性 30 s;变性 95℃ 5 s，退火 55℃ /61℃/60℃(β－actin/TYR/TYRP1)20s，循环 40 次;熔解曲线为95℃ 1 min;55℃ 1 min;55℃循环133次(每隔0.3℃采集一次荧光信号)，直到94.6℃。反应结果使用仪器自身携带的软件收集、分析。所有的样品都在同一块板中做3次重复，数值以x±s表示。

1.3.4 数据分析:

通过仪器自带的软件导出目的基因和内参基因的标准曲线方程、扩增效率以及直线方程系数(斜率)，并分析两者斜率之差。

2 结果与分析

2.1 RNA的鉴定

皮肤总RNA用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测，28S、18S条带清晰可见(图略)，说明RNA无明显降解;RNA样品的OD260/OD280均在1.8～2.0之间，所提RNA符合要求.

2.2 扩增效率分析

内参基因、TYR、TYRP1基因标准曲线建立后，分别得到标准曲线方程，其相关系数之差 ＜0.1，表明β－actin分别与 TYR、TRP1基因扩增反应效率基本一致，本实验可采用2－ΔΔT相对定量方法。其中ΔCT目的基因 =CT目的基因－CT内参基因，ΔΔCT=ΔCT黑线仓鼠－ΔCT白化突变系，TYR、TYRP1 mRNA 表达差别倍数以2－ΔΔT表示。

2.3 QRT-PCR结果

荧光定量的扩增曲线符合标准的S形扩增曲线(图1)，TYR、TYRP1基因及内参基因的扩增曲线整体无明显上扬趋势现象、平行性较好，曲线拐点清楚。

TYR、TYRP1基因与内参基因的扩增产物的熔解曲线上只有1个明显的峰(图2)，表明内参基因、TYR及TYRP1基因没有非特异性扩增和引物二聚体的产生。

2.4 TYR、TYRP1基因在黑线仓鼠与白化突变系的表达量比较分析

采用2－ΔΔT相对定量方法分析表达量，TYR基因在黑线仓鼠皮肤组织中的mRNA表达量是白化突变系的2.5倍;TYRP1基因在黑线仓鼠皮肤组织中 mRNA表达水平是白化突变系的5.3倍 (图3)。

图1 TYR、TYRP1、β－actin基因的扩增动力学曲线Fig.1 PCR amplification plots for TYR、TYRP1、β－actin

图2 TYR、TYRP1与 β －actin基因的溶解曲线Fig.2 Dissociation curve for TYR、TYRP1、β－actin gene

图3 TYR TYRP1基因的相对定量结果Fig.3 Relative quantification results of TYR、TYRP1 gene

3 讨论

酪氨酸酶(TYR)对黑色素合成过程至关重要，TYR是黑色素形成的关键酶也是限速酶之一，酪氨酸经该酶催化氧化为各种衍生物，而黑色素正是这些衍生物的聚合物。目前资料中已报道的小鼠白化性状产生的原因大多与TYR基因的突变有关，因此编码酪氨酸酶的TYR基因也就成了研究动物白化性状和人的白化病的热点候选基因。研究发现TYR的基因表达量在非色素沉着性毛发中明显低于色素沉着性毛发［7］。而本研究结果显示 TYR基因在黑线仓鼠中的 mRNA表达量是白化突变系的2.5倍，结果揭示白化突变系 TYR基因表达量的降低，促使黑色素细胞合成与沉积的黑色素减少，进而导致产生了白化毛色表型。

酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)在黑色素合成的下游调控过程中起重要作用。TYRP1是黑色素细胞特异性家族成员，由 brown位点基因编码，TYRP1基因的表达情况使毛发与皮肤产生不同颜色［8］。本研究结果表明 TYRP1 mRNA表达量在黑线仓鼠皮肤组织中是白化突变系的5.3倍，TYRP1基因在黑线仓鼠皮肤组织中的表达水平要明显高于白化突变系，结论提示黑线仓鼠 TYRP1的基因表达量与白化毛色表型的出现具有一定的相关性，认为这可能与TYRP1的表达调控序列有关，其可以调控该基因的表达量。

本研究发现了黑线仓鼠白化表型与 TYR、TYRP1的基因表达量有一定的相关性。TYR、TYRP1在黑线仓鼠中的表达量要高于白化突变系，提示TYR、TYRP1都在色素沉着过程中起到了调控作用。本研究为阐明TYR、TYRP1基因对黑色素性状的调控机制，以及黑线仓鼠白化突变系白化性状产生机理奠定了理论基础。

［1］潘兴华.黑素细胞及黑素的生成与调节［J］.生理科学进展，1998，29(2):179－181.

［2］Spritz RA，，Chiang PW，Naoki Oiso N，et al.Human and mouse disorders of pigmentation［J］.Curr Opin Genetics Dev，2003，13:284－289.

［3］Carden SM，Boissy RE，Schoettker PJ，et al.Albinism:moderm molecular diagnosis［J］.Brit J Ophthalamol，1998，82:189－195.

［4］Shiahara S，Okinaga S，Tomita Y，et al.A point mutation in the tyrosinase gene of BALB/c albino mouse causing the cysteineserine substitution at position 85［J］.Eur J Biochem，1990，189:455－461.

［5］Lefur N，Kelsall SR，Mintz B.Base substitution at different alternative splice donor sites of the tyrosinase gene in albinism［J］.Genomics，1996，37:245－248.

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Comparison of Gene Expression Levels of TYR、TYRP1 Gene in Cricetulus barabensis and the Albino mutant

ZHAO Yan－bin1，SUN Zhao－zeng1，BAI Jie－ying1，ZHANG Xiao－fei1，LI Ai－xue1，LIU Ju－xiong2，SUI Li－hua1，HU Zhong－ming1，ZENG Lin1
(1.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China)

Objective To explore the relationship between gene expression of Cricetulus barabensis TYR gene family and Cricetulus barabensis coat color.Methods The relative expression quantity of TYR，TYRP1 in Cricetulus barabensis of different colors was analyzed by using real time quantitative PCR in this research.Results The relative expression quantity of TYR，TYRP1 in Cricetulus barabensis respectively were 2.5，5.3 times than that in the Albino mutant，all results were corrected by the household gene.Conclusion The findings indicated that gene expression level of TYR gene family in Cricetulus barabensis were higher than that in the Albino mutant，and the gene expression level of TYR gene family were related with phenotype of Cricetulus barabensis coat color.

Albino mutant;Cricetulus barabensis;TYR;TYRP1;Real time quantitative PCR

Q95－331 R332

A

1671－7856(2012)07－0001－04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.001

2012－07－05

国家自然科学基金资助项目(30870347);十二五重大专项“高致病病源动物模型研究(2012ZX10004502)。

赵彦斌(1984－)，男，博士生，研究方向:实验动物学。

曾林(1965－)，男，研究员，博士生导师，研究方向:实验动物科学与管理，E－mail:zenglin1965@126.com。