猕猴B病毒gC蛋白特异性抗原表位的合成和表达

隋丽华，孙兆增，刘 一，张小飞，崔晓霞，赵彦斌，刘 冰，许 琴，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

猕猴B病毒gC蛋白特异性抗原表位的合成和表达

隋丽华，孙兆增，刘 一，张小飞，崔晓霞，赵彦斌，刘 冰，许 琴，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

目的 获得B病毒gC蛋白的特异性表位抗原。方法 利用长片段基因合成的方法，合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因，将该基因连接到pMAL-5x载体，转化到BL21受体菌进行表达，并纯化表达产物。结果 成功的获得了B病毒gC蛋白的特异性抗原蛋白，该蛋白以可溶的形式表达。结论 利用原核表达系统，可以产生B病毒gC蛋白的可溶性抗原，可以作为B病毒的检测抗原。

猕猴B病毒;C蛋白;抗原表位;合成与表达

猕猴B病毒(macaque B virus)是人兽共患病病毒，在自然宿主猕猴体内多呈潜伏感染，一般不表现临场症状。B病毒在幼猴体内的存在比率约10%左右，随着年龄的增加，阳性率越来越高，在有些饲养场的老年猴群中，B病毒的阳性率在90%左右。B病毒阳性的猕猴，终生携带病原，传染性较强。因此，及时、准确的检测出B病毒，并控制其传播，对于猕猴的生产和人兽共患病的防控，具有重要意义。

猕猴B病毒属于疱疹病毒属，为生物安全4级病原，因此在研制猕猴B病毒的检测试剂时，用全病毒做抗原检测抗体的可行性较小，而它与人的单纯疱疹病毒1型(human simple herpes virus-1，HSV-1)和人的单纯疱疹病毒2型(human simple herpes virus-1，HSV-2)病毒具有较强的抗原交叉性，目前多用人单纯疱疹病毒做抗原替代猕猴B病毒，但作为诊断试剂，不仅要求灵敏度高，而且要求具有良好的特异性，才能更好地区别B病毒与其它疱疹病毒［1，2］。

用于B病毒检测的重组抗原主要是其囊膜蛋白gB、gC和 gD，gB重组蛋白作为抗原，检出率最高，但特异性较差，gD的检出率和特异性都较差。gC蛋白作为重组抗原的检出率虽然低于 gB，但特异性强，其不仅参与病毒的吸附［8，9］，还对病毒粒子的释放、病毒的毒力以及病毒粒子的稳定性有影响［10］。其作为猕猴B病毒诊断的候选抗原具有一定优势。因此，本研究选择B病毒gC的特异性抗原表位区域，采用长片段基因合成的方法合成这段基因，并利用原核表达系统进行表达，期望获得灵敏性和特异性较好的重组蛋白，为猕猴B病毒检测试剂盒的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验用菌株和质粒

pMAL-5x载体，BL21(DE3)plys菌株为本室保存。

1.2 主要试剂

凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自杭州BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、NdeⅠ和 EcoRⅠ内切酶、ligase均为大连宝生物公司产品;E.coli DH5α感受态为北京博迈德公司产品。IPTG，X-Gal为sigma公司产品。

1.3 基因合成

从GenBank上获得B病毒的 gC蛋白序列，并将其与人的单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒等的 gC蛋白序列进行比较。选择gC蛋白序列中，抗原表位强，但与其它疱疹蛋白同源性较低的序列，进行合成，合成序列的总长度为468 bp，基因片段的两端分别添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成，命名为gC合。

1.4 pMAL-5x-gC合载体的构建

利用NdeⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶将gC合从基因合成的质粒上切下，利用ligase将片段定向连接到pMAL-5x载体。将连接后的产物转化E.coli DH5a感受态细胞，利用PCR和酶切的方法筛选出阳性质粒pMAL-5x-gC合。

1.5 合成基因的诱导表达

将pMAL-5x-gC合转化 BL21(DE3)plys感受态细胞，挑取单菌落在含10mmol/L葡萄糖的LB中37℃培养至OD值为0.6，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，室温诱导4 h。取50μL诱导后的菌液与等体积的2倍上样缓冲液混合，煮沸10 min。样品上样量为20μL，利用10%的 SDS-PAGE电泳，检测蛋白的表达情况。

1.6 重组蛋白的纯化

1L的培养基中培养细菌浓度为2×108(OD值约为0.5)，加入IPTG的终浓度至0.3mmol/L，室温(25～30℃)诱导表达4 h。离心去上清，用25mL的上柱缓冲液重悬，－20℃过夜。冰浴中融化，超声破碎，离心，保留上清，采用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化目的蛋白，用包含10mmol/L麦芽糖的上柱缓冲液进行洗脱，收集纯化蛋白，进行SDS-PAGE电泳，分离胶的浓度为10%。利用考马斯亮蓝进行染色，观察电泳结果，并照相。

2 结果

2.1 基因合成结果分析

gC合基因重组质粒的酶切鉴定见图1，基因片断与预期结果基本相符。

图1 重组质粒P5X-gC合双酶切鉴定Fig.1 Enzyme digestion analyses of the recombinant plasmid P5X-gC合

2.2 pMAL-5x-gC合载体的构建结果分析

将gC合从基因合成的质粒上切下后，利用ligase将片段定向连接到pMAL-5x载体。将连接后的产物转化E.coli DH5a感受态细胞(如图2)，利用PCR和酶切的方法筛选出阳性质粒pMAL-5x-gC合，结果如图2。

图2 重组质粒pMAL-5x-gC合PCR、双酶切鉴定鉴定Fig.2 Enzyme digestion analyses of the recombinant plasmid pMAL-5x-gC合

2.3 合成基因的诱导表达

将pMAL-5x-gC合转化 BL21(DE3)plysS感受态细胞进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳，检测蛋白的表达情况，如图3，在约70×103处出现蛋白条带，与预期重组蛋白的分子质量吻合。

图3 SDS-PAGE检测重组蛋白表达Fig.3 Detection of recombinant protein expression by SDS-PAGE

2.4 重组蛋白的纯化

重组诱导后，柱层析纯化的蛋白经 SDS-PAGE电泳，得到目的条带，可近一步用于ELISA试剂盒研制。

图4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达、纯化Fig.4 Detection of recombinant protein expression and Purification by SDS-PAGE

3 讨论

猴感染BV后，急性期在口腔或皮肤有溃疡，并排毒，约10 d症状消失，抗体上升，此时病毒潜伏于面部和生殖道附近神经节，遇机体抵抗力下降可激活病毒。猴BV在排毒期可通过接触、抓伤、咬伤传染给人，发生脑炎，死亡率达 80%［3－7］，因此 B 病毒的检测和防控具有重要的意义。但由于猴BV属于生物安全4级病原，全病毒做为抗原检查猴 BV，最低需要生物3级实验室条件才能完成，所以，一般实验室均用人单纯疱疹病毒(HSV)作为诊断抗原，此种检测方法降低了安全隐患，但检测的准确性也随之降低。

为了减少非特异性检测结果，近年来，国内已有利用基因工程技术产生猴BV囊膜重组蛋白，肖镜［3］等表达了猴 BV gD 蛋白片段，王代平［4］等表达了猴BV gC蛋白片段，均证实重组蛋白具有良好的抗原性，但抗原的特异性和灵敏性有待进一步提高。本试验选择猴BV的gC蛋白的抗原表位强，但与其它疱疹蛋白同源性较低的序列，进行合成，并对其密码子进行了优化。由该基因产生的重组蛋白，理论上抗原的特异性和灵敏性符合检测要求。

本试验利用原核表达系统对该合成基因进行了表达。原核系统表达的优点是重组蛋白产量大，但易产生包涵体，蛋白质的活性较低。因此我们选择了pMAL-5x这种表达质粒，这种重组质粒可以产生麦芽糖结合蛋白融合的重组蛋白，明显增强重组蛋白的可溶性。最终结果表明，gC合基因是以可溶的形式表达，这为下一步的检测试剂盒的制备奠定了基础。

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［10］练蓓，程安春，汪铭书.疱疹病毒gC基因及其编码蛋白研究进展［J］.中国动物传染病学报，2009，17(2):82－86.

Synthesis and Expression of Monkey B Virus Glycoprotein C Specific Antigen Epitope

SUI Li-hua，SUN Zhao-zeng，LIU Yi，ZHANG Xiao-fei，CHUI Xiao-xia，ZHAO Yan-bin，LIU Bing，XU Qin，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

Objective To get specific antigen epitope of B virus gC protein.Methods Synthesis specific antigen epitope of B virus gC gene by using synthesis gene of Long fragment，cloned the gene into the pMAL-5x vector and transformed into E.coli BL21 to express and purify the expression product.Results We get the B virus gC protein specific antigen protein successfully，and the protein expression in soluble form.Conclusion Prokaryotic expression system can produce soluble B virus gC protein antigen and can be used as the detection of B virus antigen

Macaque B Virus;gC protein;Antigen epitope;Synthesis and expression

Q95-331;R332

A

1671-7856(2012)07-0021-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.006

2012-07-05

十二五重大专项“高致病病原动物模型研究”(2012ZX10004502)。

隋丽华(1970－)女，高级实验师，研究方向:实验动物微生物检测。

曾林(1965－)研究员，研究方向:实验动物科学与管理。