鹿蹄草素酯类衍生物的合成及抗菌活性研究

何 勇 李家明

1.安徽省池州市人民医院药剂科，安徽池州 247000；2.安徽中医学院药学院，安徽合肥 230031

氢醌类化合物（hydroquinone）作为醌类物质的一类，易氧化成对苯醌类衍生物，还原又恢复为原来的氢醌类，所以它们既起到了传递电子的作用，又能影响某些生化反应的过程[1-2]。鹿蹄草素（Pyrolin）是一种有代表性的氢醌类化合物，抗菌作用较强，抗菌谱广，毒性低，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等都有抑制作用，临床试验表明其对呼吸道、尿道、消化道及创口感染等都有良好的疗效，对真菌及某些昆虫也有杀灭作用[3-5]。体外药效学试验结果表明，鹿蹄草素作为一种广谱抗菌药物，对G+和G－菌的体外抑菌效果均超过青霉素[6]。艾启俊等[7]通过对鹿蹄草素作用下的金黄色葡萄球菌生长曲线、膜通透性和结构进行研究发现，鹿蹄草素的抑菌性和杀菌功能与其对金黄色葡萄球细胞膜和细胞壁结构的破坏直接相关。但鹿蹄草素在生物体内极易被肝脏氧化酶系代谢成醌类而失去活性。徐文方等[6]对鹿蹄草素进行了体内外药效学研究，结果表明鹿蹄草素在家兔体内的代谢速度极快。由于鹿蹄草素在生物体内易失活，半衰期短，代谢速度快，因此从延长药物作用时间、减少给要次数、方便患者用药的方面考虑，利用前药原理，将鹿蹄草素的基本化学结构中两个酚羟基酰化保护，合成系列鹿蹄草素酰基化合物，使其进入体内后，经血清酯酶降解，缓慢释放出母体药物鹿蹄草素而发挥抗菌作用，在预期达到理想的体内药效的同时，还可降解并释放一些其他基团，发挥其他基团的药效作用。

1 仪器及试药

DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（黄峪予华仪器制造厂）；WRS-1B数字熔点仪（上海精密科学仪器有限公司），温度未校正；CP225D十万分之一电子天平（Sartorious）；LCQ ADVANTAGE MAX液质连用质谱仪 （FINNIGAN公司）；Bruker 300 MHz超导核磁共振仪，TMS为内标，CDCl3为溶剂；Nicolet Avatar 370DTGS型红外光谱仪 （therm-electron corporation）。

鹿蹄草素（自制，含量为 98%），mp.127.2～127.6℃（文献参考值为mp.126～127℃[8]），烟酸 （郑州蓝宇化工有限公司，100 g/瓶），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鹿蹄草素衍生物的合成方法

2.1.1 双乙酰化鹿蹄草素的合成 在250 mL圆底烧瓶中加入鹿蹄草素（5.00 g，0.040 mol）、乙醚（150 mL），搅拌溶解后，加乙酸酐（10.0 mL，0.106 mol）、吡啶（10 mL），室温搅拌反应 24 h，TLC监控反应。待原料基本反应完全后，向反应液中加冰水20 mL，用分液漏斗分离出乙醚层，先后用1%NaHCO3、饱和CuSO4溶液、冰水洗涤，减压蒸出乙醚，残留物用少量乙酸乙酯溶解，经硅胶G层析柱分离纯化，得白色晶体（7.3g，86.9%），mp.43.9～44.7℃。1H-NMR （CDCl3，300 MHz）δ：2.17（s，3H），2.28（s，3H），2.31（s，3H），6.93（m，3H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：169.3，169.0，148.1，146.7，131.4，123.9，122.6，119.8，21.0，16.2；IR（KBr，cm-1）υ：2936.3，1756.3，1617.1，1496.4，1212.5，867.3；ESI-Mass m/z：209.12（M++H）。

2.1.2 双丙酰化鹿蹄草素的合成[9]称取鹿蹄草素 （5.00 g，0.040 mol）、二甲氨基吡啶（DMAP，1.50 g），加入 250 mL 三颈烧瓶中，加入苯（125 mL）、丙酰氯（11.9 mL，0.136 mol），回流（85℃）5 h，TLC 监控反应。 反应结束时，在加热回流（85℃）搅拌条件下，缓慢滴加饱和NaHCO3溶液调pH至碱性，冰水洗涤，分离苯层，干燥，除苯。剩余物用少量乙酸乙酯溶解，用硅胶G层析柱分离纯化，得白色固体（6.2 g，65.7%），mp.49.0～51.0℃。1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：1.27（q，6H），2.16（s，3H），2.53～2.64（m，4H），6.90～7.02（m，3H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：172.9，172.6，148.2，146.8，131.4，123.9，122.7，119.8，27.7，27.6，16.3，9.2，9.1；IR（KBr，1/cm） υ：2 986.6，2 943.7，1 764.5；ESI-Mass m/z：258.92（M++H）。

2.1.3 双苯甲酰化鹿蹄草素的合成 在150 mL三颈烧瓶中加鹿蹄草素（3.00 g，0.024 mol）、苯（75.0 mL）、苯甲酰氯（8.4 mL，0.072 mol）、吡啶（6 mL），搅拌下，加热回流反应 5 h，TLC 监控反应。待原料基本反应完全后，减压蒸出苯，残留物用氯仿溶解，加饱和NaHCO3溶液50 mL搅拌20 min，分出氯仿层，用冰水洗涤，氯仿层干燥，减压回收氯仿，残留物用硅胶G层析柱分离纯化，得白色晶体。45℃干燥12 h，得白色晶体 7.2 g （89.7% ），mp.119.8～120.2℃ 。1H-NMR （CDCl3，300 MHz） δ：2.27 （s，3H），7.13～7.26 （m，3H），7.50～7.56 （m，4H），7.64～7.66 （m，2H），8.19～8.24 （m，4H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MH z） δ：165.2，164.9，148.6，147.2，133.7，131.9，124.2，123.0，120.1，16.5；IR（KBr，cm-1）υ：2 924.2，1 735.0，1 594.6，1 451.4，1 260.8；ESI-Mass m/z：333.25 （M++H）。

2.1.4 双烟酰化鹿蹄草素的合成 在带尾气吸收装置的100 mL圆底烧瓶中，加入烟酸（10.0 g，0.081 mol）、SOCl2（40 mL），搅拌下加热回流3 h，减压蒸出SOCl2，得淡黄色固体烟酰氯。将烟酰氯转移至250 mL三颈烧瓶中，在冰浴冷却下，边搅拌边缓慢滴加鹿蹄草素吡啶溶液[鹿蹄草素（4.0 g，0.032 mol）用吡啶（20 mL）溶解]，加完后再加吡啶（80 mL）。加热至 90℃搅拌反应5 h，TLC监控反应。待原料基本反应完全后，减压蒸去吡啶，残留物用氯仿溶解，冰水洗涤，分离出氯仿层经钠干燥，抽滤后减压回收氯仿，得白色略带黄色固体。将所得固体用无水乙醇重结晶。产品在48℃干燥12 h，得双烟酰化鹿蹄草素白色晶体 7.5 g，收率为 69.4%，mp.144.0～144.3℃；1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：2.28（s，3H），7.14～7.26（m，3H），8.46～8.50（m，2H），8.88（s，2H），9.42（d，2H，J=8.64 Hz）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz） δ：163.8，163.5，148.2，146.9，131.9，123.5，122.9，120.1，16.5；IR（KBr，cm-1） υ：2 996.3，1738.1，1586.9，1495.1，895.5，803.2；ESI-Mass m/z：335.33（M++H）。

2.1.5 双乙酰水杨酰化鹿蹄草素的合成 在带尾气吸收装置100 mL 圆底烧瓶中，加入乙酰水杨酸（12.0 g，0.067 mol）、氯仿（50 mL）、SOCl2（10 mL），搅拌下加热回流反应 5 h，减压蒸出氯仿和SOCl2，得无色液体乙酰水杨酰氯。在150 mL三颈烧瓶中，加鹿蹄草素（3.00 g，0.024 mol）、吡啶（60 mL）溶解，在冰浴冷却下，边搅拌边缓慢滴加乙酰水杨酰氯，滴加完毕后于室温搅拌反应12 h。TLC监控反应，待原料基本反应完全后，减压蒸去吡啶，残留物用氯仿溶解，先后用10%盐酸、冰水洗涤，分离出氯仿层，经干燥，抽滤，减压回收氯仿，残留物用乙酸乙酯重结晶，得褐色固体。用硅胶G层析柱分离纯化，氯仿∶甲醇（100∶1，V/V）洗脱剂，收集产物，减压回收溶剂后得白色晶体。45℃干燥12 h，得双乙酰水杨酰化鹿蹄草素4.2 g，收率为 38.7%，mp.200.0～202.0℃。1H-NMR（CDCl3，300 MHz） δ：2.24 （s，3H），2.32 （s，3H），7.08 ～7.21 （m，5H），7.65～7.67（m，2H），8.20～8.25（m，2H）；13C-NMR（CDCl3，75.5 MHz）δ：163.0，162.6，148.3，147.0，132.1，124.2，123.1，120.3，16.5；IR（KBr，cm-1） υ：1 762.8，1 739.8，1 487.9，1 446.3，1 249.5；ESI-Mass m/z：471.01（M++Na）。

2.2 鹿蹄草素衍生物的药理实验

2.2.1 统计学方法 应用SPSS 12.0 软件进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2.2.2 对大肠杆菌感染小鼠的保护作用 取体重18～22 g昆明种小鼠70只（由南京医科大学提供，许可证号：SCXK（苏）2002-0031），雌雄各半，按体重随机分成对照组、鹿蹄草素组（Ⅰ组）、双乙酰化 LTCS组（Ⅱ组）、双丙酰化 LTCS组（Ⅲ组）、双苯甲酰化LTCS组（Ⅳ组）、双烟酰化LTCS组（Ⅴ组）、双乙酰水杨酰化LTCS组（Ⅵ组），根据小鼠灌胃大肠杆菌菌液0.6 mL（细菌浓度为3 ×109cfu/mL），各组分别按剂量灌胃给药0.1 mL/10 g体重，连续3 d，连续观察，统计7 d内小鼠的死亡情况。结果见表1。

表1 各组对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用

由表1 可见，腹腔注射大肠埃希菌菌液后，对照组小鼠全部死亡（死亡率为100%，存活率为0），而用药后各剂量组均不完全死亡（存活率为30%～60%），其中鹿蹄草素组（Ⅰ组）存活率为30%，而双乙酰化LTCS组（Ⅱ组）为50%，双丙酰化LTCS组（Ⅲ组）为40%，双苯甲酰化LTCS组（Ⅳ组）为40%，双烟酰化LTCS组 （Ⅴ组）为50%，双乙酰水杨酸化LTCS组（Ⅵ组）为60%，上述各组与Ⅰ组相比存活率均明显提高（P<0.05），其中Ⅵ组作用最为明显（P<0.01）。

2.2.3 对金黄色葡萄球菌感染小鼠体内的保护作用[7]取体重18～22 g昆明种小鼠70只（由南京医科大学提供，许可证号：SCXK（苏）2002-0031），雌雄各半，按体重随机均分成对照组、鹿蹄草素组（Ⅰ组）、双乙酰化LTCS组（Ⅱ组）、双丙酰化LTCS组（Ⅲ组）、双苯甲酰化LTCS组（Ⅳ组）、双烟酰化LTCS组（Ⅴ组）、双乙酰水杨酰化LTCS组（Ⅵ组），根据小鼠灌胃金黄色葡萄球菌菌液0.8 mL（细菌浓度为3 ×109cfu/mL），同时，各组分别按剂量灌胃给药0.1 mL/10 g体重，连续3 d，连续观察，统计7 d内小鼠的死亡情况。结果见表2。

表2 各组对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用

由表2 可知，腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液后，对照组小鼠全部死亡（死亡率为100%，存活率为0），而用药后各剂量组均不完全死亡（存活率为50%～70%），其中鹿蹄草素组（Ⅰ组）存活率为50%，而双乙酰化LTCS组（Ⅱ组）为60%，双丙酰化LTCS组（Ⅲ组）为50%，双苯甲酰化LTCS组（Ⅳ组）为60%，双烟酰化LTCS组（Ⅴ组）为60%，双乙酰水杨酸化LTCS组（Ⅵ组）为70%，与Ⅰ组比较，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组存活率均明显提高（P<0.05）。

3 讨论

为了解决鹿蹄草素体内代谢过快的问题，笔者应用前药原理，对鹿蹄草素的酚羟基进行保护，做成系列鹿蹄草素酰基化合物，分别是双乙酰化鹿蹄草素、双丙酰化鹿蹄草素、双苯甲酰化鹿蹄草素、双烟酰化鹿蹄草素、双乙酰水杨酰化鹿蹄草素，并且通过IR、1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS确证了其化学结构。其中双苯甲酰化鹿蹄草素、双烟酰化鹿蹄草素、双乙酰水杨酰化鹿蹄草素为新化合物。

鹿蹄草素及其衍生物体内抗菌试验中，鹿蹄草素及其衍生物能够使大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率显著提高，说明鹿蹄草素及其衍生物有较好的抗菌作用，而双乙酰化LTCS组、双丙酰化LTCS组、双苯甲酰化LTCS组、双烟酰化LTCS组、双乙酰水杨酸化LTCS组的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率，与鹿蹄草素组比较，均有所提高，说明鹿蹄草素衍生物抗菌作用强于鹿蹄草素，可能是衍生物在体内经水解酶系作用缓慢释放鹿蹄草素，解决了鹿蹄草素半衰期过快等不足的缘故。

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