Ras相关核蛋白和缺氧诱导因子HIF-1α在胃癌组织中的表达及临床意义

肖 琳 杨 坚

1.湖南省湘潭市中心医院消化内科，湖南湘潭 411100；2.湘潭职业技术学院，湖南湘潭 411100

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。根据2000年资料统计，在全世界范围内，每年新发胃癌人数为876 000例，占所有新发癌症病例的9%，胃癌发病率仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居恶性肿瘤第四位[1]。我国每年有30 万人死于该病，胃癌的侵袭和转移是生存率明显降低的主要原因，研究表明癌症的侵袭和转移是多阶段、多基因参与的结果[2]，但胃癌的发生、发展、转移机制至今尚不清楚，因此涉及肿瘤浸润、转移的基因成为当前研究的热点之一。Ras相关核蛋白（Ran）是Ras类原癌基因的一员，是一种分布于细胞核内的小G蛋白，研究证实Ran是一种重要的细胞增殖调控因子，参与纺锤体的形成、DNA的复制和细胞核膜的重建等[3]。Azuma等[4]发现Ran是一种新的肿瘤相关抗原，其在多种肿瘤细胞和组织中表达增高，但在胃癌组织中尚未见报道，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧诱导下肿瘤细胞产生的一种核转录因子，在缺氧条件下，HIF-1α的表达水平增高，可以调控多种靶基因的表达，本研究运用免疫组织化学技术，检测Ran与HIF-1α在胃癌中的表达及其相互关系，探讨它们与胃癌生物学行为的关系，为临床防治胃癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集湘潭市中心医院2009年5月～2011年5月手术切除的胃癌标本及其配对的距癌灶5 cm以上的癌旁组织标本各70例，标本均经组织病理确诊，患者术前均未接受放化疗。其中，男40例，女30例，年龄35～76岁，中位年龄58岁，胃癌患者临床分期按2003年国际抗癌联盟 （UICC）颁布的胃癌TNM分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例，Ⅳ期9例；胃癌分化程度：低分化腺癌26例，中分化腺癌29例，高分化腺癌15例；胃癌浸润深度：浸润黏膜层及黏膜下层（T1）5例，浸润固有肌层（T2）19例，浸润浆膜层（T3）34例，浸润邻近器官或组织（T4）12例；淋巴结转移：无转移27例，有转移43例。

1.2 主要试剂

鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人Ran多克隆抗体及其他相关试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法

每个石蜡标本4 μm厚度连续切片，摊片后，切片放置于60℃温箱烘烤2 h预处理。采用免疫组织化学染色PV9000二步法，具体步骤如下：切片60℃预热30 min。石蜡切片常规脱蜡水化（二甲苯脱蜡10 min×2，梯度酒精水化95%3 min×3，80%3 min，70%3 min，蒸馏水 5 min×2）。 煮沸修复：取一定量枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）于不锈钢压力锅中加热至沸腾，切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热6 min），计时2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，先用蒸馏水冲洗3 min×3，然后用PBS（pH=7.2～7.4）冲洗 3 min×2。 3%过氧化氢室温下孵育 10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加一抗，室温下孵育1 h，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加聚合物辅助剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，室温孵育30 min，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加新鲜配制的DAB底物显色液，显微镜下观察3～5 min，至出现阳性结果而又无明显背景着色，中止反应，自来水冲洗。苏木素复染，1%盐酸分化，氨水反蓝，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗，步骤同上，作阴性对照。

1.4 免疫组化结果判定

以细胞胞浆或胞膜出现黄色颗粒为阳性，根据细胞染色强度及染色细胞所占百分比计分，以计分之和来判断结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分， 阳性细胞数＜10%为1分，10%～24%为2分，25%～49%为3分，≥50%为 4分。按计分之和分为 4个等级：-（0）；+（1，2）；++（3，4）；+++（5，6），计分之和＞2 分为高表达，≤2 为低表达。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0 统计学软件处理实验数据，计数资料组间比较采用χ2检验，等级相关资料采用Spearman等级相关检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ran和HIF-1α在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况

Ran和HIF-1α的阳性表达主要在细胞核，部分胞质中也可见阳性表达，胃癌组织中Ran和HIF-1α的阳性表达率分别为45.71%.和77.14%，与正常胃黏膜组织比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表1～2。

2.2 Ran和HIF-1α在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系

2.2.1 Ran在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系Ran 在 T1、T2、T3、T4 的阳性表达率分别为 20.00%（1/5）、26.32%（5/19）、47.06%（16/34）及 83.33%（10/12）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为 14.29%（1/7）、33.33%（7/21）、51.52%（17/33）及 77.78%（7/9）；淋巴结转移组的阳性表达率为62.79%（27/43），无淋巴结转移组的阳性表达率为18.52%（5/27），差异均有统计学意义（均 P ＜ 0.05）。但 Ran表达与肿瘤分化程度无明显关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.2.2 HIF-1α在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系 HIF-1α 在 T1、T2、T3、T4 的阳性表达率分别为 40.00%（2/5）、63.16%（12/19）、85.29%（29/34） 及 91.67%（11/12）；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为42.86%（3/7）、66.67%（14/21）、84.85%（28/33）及 100.00%（9/9）；淋巴结转移组的阳性表达率为88.37%（38/43），无淋巴结转移组的阳性表达率为59.26%（16/27），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。但HIF-1α表达与肿瘤分化程度无明显关系，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表4。

2.3 Ran和HIF-1α在胃癌组织中相关性

Ran和HIF-1α在胃癌中的表达，经Spearman等级相关统计学处理（r=0.363，P＜0.05），两者呈正相关。见表5。

表1 Ran在胃癌组织和正常胃黏膜组织中免疫组化染色的情况

3 讨论

Drivas等[5]首次在人畸胎瘤细胞cDNA中发现Ran的开放阅读框，并分离纯化证实Ran具有GTP酶活性，研究发现Ran可激活Cdc2/cyclin B蛋白激酶使细胞进入有分裂期[6]，Ran的功能异常可以促进细胞转化和肿瘤发生[7]，这些研究提示Ran可能参与调控多种肿瘤的发生，Morgarr-lappe等[8]利用肺癌细胞系H1299 对3 700个基因的siRNA文库进行高通量筛选，发现Ran siRNA可抑制多种肿瘤细胞生长，Honma等[9]发现Ran的表达下调可引起人结肠癌细胞HT-29的凋亡，但是Ran在胃癌组织中的表达未见报道，本研究表明Ran在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且胃癌分期越晚、浸润越深、伴淋巴结转移其表达水平越高，结果表明Ran可能参与了胃癌早期癌变的发生过程，但其具体的作用机制有待进一步研究。

表2 HIF-1α在胃癌组织和正常胃黏膜组织中免疫组化染色情况

表3 Ran与临床病理特征间的关系

表4 HIF-1α与临床病理特征间的关系

表5 Ran与HIF-1α的相关性

HIF-1 是缺氧调节下广泛存在于哺乳动物和人体内产生的一种异源二聚体转录因子，在缺氧诱导的基因表达中起关键作用，HIF-1 主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，其中,HIF-1α是唯一的氧调节亚单位，它决定HIF-1 的活性[10]，其靶基因涉及肿瘤细胞能量代谢、血管生成和肿瘤转移等，Zhong等[11]分析了179例不同类型肿瘤标本中HIF-1α的表达，发现在包括前列腺癌、乳腺癌、胃癌等13 种肿瘤标本中可见HIF-1α呈不同程度的表达，而在相应的良性肿瘤中没有检测到HIF-1α，Zhong的研究在本实验中得到进一步证实，本研究显示HIF-1α与胃癌临床分期、浸润深度、淋巴结转移有关，这说明HIF-1α在胃癌中的过度表达对胃癌的发生、发展可能有一定的意义。

关于Ran和HIF-1α两者之间的研究甚少，经相关性分析发现，两者具有正相关性，这提示Ran与HIF-1α存在着调控关系，HIF-1α/Ran通路在调节肿瘤细胞增殖过程中具有十分重要的作用，两者在胃癌的侵袭、转移过程中可能具有协同作用，由此笔者认为Ran和HIF-1α共同参与了胃癌的发生、发展，HIF-1α可能通过上调Ran蛋白表达，促进肿瘤细胞的增殖，进而促进胃癌的转移，两者之间的相互作用还需进一步研究。

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