紫外光照下高铁肌红蛋白的还原

安良梅曹洪玉,2唐 乾郑学仿＊,,2

(1大连大学生命科学与技术学院，大连 116622)

(2辽宁省生物有机化学重点实验室,大连大学，大连 116622)

紫外光照下高铁肌红蛋白的还原

安良梅1曹洪玉1,2唐 乾1郑学仿＊,1,2

(1大连大学生命科学与技术学院，大连 116622)

(2辽宁省生物有机化学重点实验室,大连大学，大连 116622)

实验中我们发现紫外波段光源照射高铁肌红蛋白(metmyoglobin，metMb)时，能发生与添加化学还原剂还原metMb相似的过程，本文采用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)，圆二色光谱(CD)研究了metMb在特定紫外光源下的还原过程。580 nm和544 nm处还原峰的面积变化显示，metMb在光照时能被还原至MbFe（Ⅱ）H2O状态，且不同的光源、特定紫外定波长、温度、pH以及不同气体存在等条件下metMb的还原程度不同。在温度为10℃，偏碱性条件时，定波长254 nm照射有利于metMb还原；气体存在时，由于气体小分子与血红素铁的配位能力不同，不同气体对光照metMb还原的催化作用程度也有差异，CO和O2的存在对此过程有催化促进作用，这一结论在医学和生理学上有重要的意义。

高铁肌红蛋白；紫外光照射；光照还原；紫外可见吸收光谱；气体小分子

0 引 言

血红素蛋白在生物体内具有很多重要的功能，如储存和运输O2、电子转移、生物催化剂和小分子生物感应器(O2,NO和CO)等[1-2]。肌红蛋白(myoglobin,Mb)是研究蛋白质结合动力学[3]和分子构象改变[4]的模型蛋白，由一条多肽链和一个血红素辅基构成，在体内与O2分子结合起着储存和促进氧在细胞中扩散的作用；它还能与CO和NO[5]等小分子配体可逆结合，从而调控其它蛋白的生理功能。Mb活性中心的血红素Fe(Fe2+或Fe3+状态)有6个配位轨道，其中4个与卟啉环的N原子相连，第五配位与近端His 93残基的咪唑氮结合[6],第六配位空置(deoxyMb)或与小分子配体结合。血红素内Fe呈Fe2+状态时可以与小分子配体如O2和CO结合形成MbO2和MbCO，呈Fe3+状态时可以与水分子配体结合形成metMb。远端His 64是O2或其他小分子配体进入血红素疏水空穴的通道，MbO2中的 O2和 metMb的H2O分子通过氢键与His 64的N紧密连接[7-8]。

目前国内外多是在极端低温条件下利用X-射线或外加光敏剂照射metMb晶体，研究其光还原过程[9-10]。在超低温时抹香鲸的metMb被X-射线还原能产生Fe(II)低自旋肌红蛋白中间态[9,11-12]。此中间亚稳态仍然结合一水分子，但是卟啉环的铁由三价高自旋态变成了二价低自旋态，中间态MbFe(II)H2O通过水分子的氢键与远端His 64稳固连接。X射线照射还原的MbFe（Ⅱ）H2O在低于140 K时为亚稳态;温度升高时,水分子解离，变成高自旋的deoxyMb[13]，近端His 93距离铁平面缩短了0.015 nm，铁平面的位置变换有利于H2O解离[14]，同时珠蛋白构象发生变化，此发现具有重要的医学和生理学意义。

上述研究metMb的还原过程多在超低温晶体条件下，我们前期研究发现，在普通光照条件下，就能把metMb还原到二价状态，其紫外光照还原机理为光诱导的分子内电子转移[15]，本文进一步研究此还原过程，运用紫外可见光谱、紫外二阶导数光谱、圆二色光谱等方法，通过研究光照后Q带还原峰面积的变化，探讨metMb溶液在常温下的光照还原机制及其对不同外界因素的依赖性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

将马心肌红蛋白(metMb)样品(美国Sigma公司)，溶解于 0.05 mol·L-1的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系(pH=6.0，7.4，8.0)中，制备成浓度为 1×10-5mol·L-1的蛋白溶液，冷冻避光保存。还原剂为0.1 mol·L-1连二亚硫酸钠溶液，氧化剂为0.1 mol·L-1的铁氰化钾。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

metMb溶液纯度的鉴定[15]：向马心肌红蛋白样品中加入过量0.1 mol·L-1氧化剂铁氰化钾(最终浓度比为1∶100时)，经过柱层析后测得紫外吸收光谱发现，样品的吸收带形状几乎没有变化，所以购买的马心肌红蛋白几乎全部是高铁肌红蛋白(metMb)。

（ⅰ） 光源：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于5 mL离心管中，将样品置于冰上，保持温度恒定，分别在正午阳光、日光灯、紫外杀菌灯3种光源下照射2 h；对照样不做其他任何处理。

（ⅱ） 定波长：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于荧光比色皿中，在FP-6500型荧光光谱仪中分别使用254、280、409和430 nm 4种波长在 20℃下照射蛋白样品2 h；

（ⅲ） 温度：取3 mL pH=7.4的metMb溶液置于荧光比色皿中，置于FP-6500型荧光光谱仪中使用254 nm波长照射2 h，照射时的温度分别设为4、10、25和35℃；

（ⅳ） pH：分别取 3 mL pH为 6.0、7.4 和 8.0 的metMb溶液，置于荧光比色皿中，置于FP-6500型荧光光谱仪中使用254 nm波长在10℃下照射2 h；

利用露点控制和气候补偿技术，该系统还实现了利用地板辐射制冷的功能。通过温湿度传感器采集当前室内的温度和湿度，中央控制器计算出当前的露点温度，通过调节混水阀控制地暖的供水温度使水温一直在露点温度以上，保证室内不会结露，通过风盘除湿来保证室内湿度恒定。

（ⅴ） 气体：取 3 mL pH=7.4的 metMb溶液，控温在10℃置于FP-6500型荧光光谱仪中使用254 nm波长照射2 h，照射的同时分别通入恒定的气体流(分别为 O2、N2和 CO)。

1.2.2 光谱测定

紫外可见光谱测定：狭缝宽度2 nm，扫描波长范围为 220～750 nm，扫描速度 200 nm·min-1，响应时间为中等，扫描3次。

圆二色光谱测定：带宽为4 nm，扫描波长范围为250～190 nm，灵敏度为标准，扫描速度50 nm·min-1，响应时间 2 s，扫描 3 次。

2 结果与讨论

2.1 metMb化学还原与光照还原比较

metMb的三价铁结合水的吸收峰在409、502和630 nm左右，而肌红蛋白二价铁结合态在波长420、540和580 nm左右处有最大吸收峰，二价铁离子还原态的最大吸收峰在430和560 nm左右[16]。metMb溶液在409 nm(Soret带)处吸收强度最大，加入连二亚硫酸钠 (与metMb的物质的量浓度比为5∶1)时，metMb在409 nm处吸光度降低并红移，在Q吸收带544 nm和580 nm处出现新吸收峰；当二者浓度比达到10∶1时，Soret吸收带红移到430 nm，而544 nm和580 nm的两个峰逐渐合成一个在552 nm的大吸收峰；继续增加连二亚硫酸钠的浓度，Soret带和Q带吸收峰位置和强度均变化不大。由此可知连二亚硫酸钠还原metMb的过程是分三个不同阶段：MbFe（Ⅲ）H2O(a 态)⇌MbFe（Ⅱ）H2O(b 态)⇌MbFe（Ⅱ）(c，d态)，如图1所示。这与文献报道的在超低温晶体状态时，X-射线晶体衍射实验将高铁肌红蛋白还原，并得到稳定的结合水的中间态[12]，温度升高后中间态会失去水变成二价铁还原态[13]的结论一致。

我们在常见条件下光照还原metMb时，发现与上述过程类似的现象。实验中我们对metMb溶液进行不同光照时间处理时，发现光还原可使metMb达到二价结合水的状态，即MbFe（Ⅲ）H2O(a态)⇌MbFe（Ⅱ）H2O(b态)，如图2所示。光照还原metMb的机理[15]为光诱导的分子内电子转移，这是由于在光照过程中，metMb的辅基铁卟啉环受激发后发生了电子跃迁，在409 nm左右a1u(π)-eg(π*)电子跃迁产生的Soret带可归属为π-π*跃迁产生的第二电子激发态 S2[18]；在 500～650 nm 区间由 a2u(π)-eg(π*)电子跃迁产生的4个Q带归属于π-π*跃迁产生的第一电子激发态S1，还有金属Fe离子也可以占有d轨道，出现d-d跃迁[20]，这些光诱导的轨道跃迁属于分子内电子转移跃迁。

2.2 不同条件下光照还原metMb 2.2.1 光源不同

从紫外可见吸收光谱(图3A)和紫外二阶导数光谱(图3B)可见各吸收峰强度的变化情况：未经光照射处理的样品，在Q吸收带503 nm和630 nm处光吸收强度最大；日光灯照射的样品与未经光照射处理的样品相比，基本没有变化；阳光和紫外灯照射的样品光谱在503 nm和630 nm处吸收峰强度减小，544 nm和580 nm处吸收峰强度明显增大，并且紫外灯照射引起的光吸收强度变化最大。

因此在相同的照射时间下，metMb被还原的程度趋势为：在紫外灯下还原程度最大；阳光相对紫外灯光源，紫外线强度低，引起metMb被还原的程度减小；而日光灯的波长范围基本在可见光范围，即400 nm到750 nm，不能激发蛋白以提供还原所需的电子，相应的紫外吸收光谱基本没有变化。由此可见是紫外波段光的光源引起metMb部分还原。

2.2.2 不同定紫外波长下metMb光照还原

为进一步考察紫外波段光源照射metMb还原情况，我们选用FP-6500型荧光光谱仪上氙灯的不同定波长来光照metMb。

metMb样品在不同定波长(254,280,409和430 nm)氙灯光照后Soret带409 nm处峰强度降低并轻微的红移，在Q带503 nm和630 nm处峰吸收强度降低，544 nm和580 nm处峰吸收强度增强(图4A)；544 nm和580 nm处峰面积在随着光照时间增加不断增大 (图4B、C)。当使用不同定波长的光照射蛋白时，Q带的峰的面积变化也不相同，其中254 nm光照射时544 nm和580 nm峰的面积增加的趋势最大，即还原产物MbFe（Ⅱ）H2O较多。

由此可见，紫外光能量越高，metMb更易被还原。在近紫外光区(200～400 nm)周围波段光源易于其还原，可能与蛋白含芳香族氨基酸 (如Tyr或Trp)有关，芳香族氨基酸残基可作为电子供体引导还原反应[21]。

2.2.3 不同温度下metMb紫外光照还原

从图5可以看出，metMb在580 nm和544 nm处峰面积随着光照时间延长呈现递增的趋势。在温度为4℃或10℃时，光照后的蛋白在580 nm和544 nm处的峰面积增加较大。温度为35℃时峰面积变化最小，光照40 min后峰面积增加平缓。图5说明溶液状态下低温有利于metMb的还原，即在光还原MbFe（Ⅲ）H2O→MbFe（Ⅱ）H2O过程中，温度越低，metMb被光照还原的能力越强。

2.2.4 不同pH 下metMb光照还原

肌红蛋白溶液在酸性条件下为单体，在pH达到9时溶液中氢氧根的浓度足够大，从而取代了原来血红素中第六配位的水进行配位[22]，紫外图谱中在586 nm处已经形成一个新峰，pH＞9时肌红蛋白还易形成二聚体，酸性条件下蛋白易变性，为此我们考察了 pH为 6.0、7.4、8.0 的高铁肌红蛋白缓冲溶液的光照情况。在3个pH值下，metMb在Soret带(表1)和Q带(图6A)的吸收强度基本不变。在温度10℃下，使用氙灯254 nm单色光分别照射3种不同pH值下的metMb溶液，其580 nm和544 nm处峰面积随照射时间变化的谱图如图6B、C。在光照处理前后，pH为8.0时两处峰面积均比pH为7.4 或 6.0 时面积大；pH为 6.0 的样品在光照的前90 min，两处峰面积均有所增加，90 min后基本不再变化；而pH为7.4和8.0样品两处峰面积均随着光照时间的增加而增大，说明偏碱性条件有利于metMb的光照还原。

表1 在温度为10℃，254 nm光照不同pH的metMb，对Soret带的影响Table 1 Effects of Soret band at 10℃,254 nm Irradiation under different pH values of metMb

光照metMb在不同pH时对Soret带的影响如表1所示，随着pH的增加，光照影响Soret带的吸收强度变化由0.1591升高到0.2153，并且其在光照后Soret带发生红移，碱性条件下红移更大。metMb在偏碱性条件下易于被光照还原，可能与metMb在不同pH时的结合态有关。在偏碱性时易于形成稳定的高自旋三价结合水态；在酸性条件下，高铁肌红蛋白的组氨酸残基发生质子化，转移氢键，三价结合水态较不稳定[23]。

2.2.5 通入气体对光照metMb还原的影响

CO，O2分子都可以与还原态肌红蛋白[24]结合，不与高铁肌红蛋白结合，图7是不同气体存在条件下光照引起高铁肌红蛋白还原的结果。光照条件下有无气体都能引起metMb的还原，但在有气体特别是CO和O2时，更有利于蛋白还原。在540 nm、579 nm出现MbCO(e)的特征吸收峰，证明metMb被还原后立刻与通入的CO结合；544 nm和581 nm处峰显示N2存在时metMb转化率较低，相比较O2存在时metMb光照下被还原转化率则较高。O2存在下光照的样品(c)与没有外加气体仅光照2 h的蛋白样品(b)紫外光谱图基本相似，说明空气中氧气量足以催化metMb还原。这可能是由于气体与Fe2+的配位能力CO＞O2＞H2O＞N2，根据配位能力气体对光照还原的metMb催化促进作用也不同；与H2O相比CO、O2能更好的与Fe2+结合，使光还原MbFe（Ⅱ）H2O→ MbFe（Ⅲ）H2O更易于向正反应方向进行，CO、O2对光照还原metMb有正催化促进能力。这是由于metMb在光照后卟啉环上的电子受激发，发生了ππ*电子跃迁，电子从卟啉环转移到中心铁原子，使得三价铁得到一个电子变为二价铁，当有CO存在时更能稳定的结合到还原的二价铁上，使还原后的蛋白形成稳定的MbCO[21]。其反应式如下：

2.3 不同气体存在时metMb光照还原的二级结构变化

蛋白质折叠结构不同，其活性生色基团的光学活性也不同，圆二色性将呈现较大的差异。根据所测得蛋白远紫外CD谱，能反映出蛋白二级结构的信息[25-26]。

光照时不同气体的通入引起metMb二级结构变化是不同的。如图8 CD图谱所示通入O2或在空气中光照2 h的蛋白样品与通入N2时明显不同，N2存在时metMb还原率明显降低，这与图7紫外光谱图结论一致。通过圆二色光谱二级结构分析软件算出，光照还原后蛋白α-螺旋含量由光照前的64.9%下降到 56.6%，CO、O2存在时 α-螺旋含量下降最大，分别下降9.3%和8.7%，而N2存在时α-螺旋含量反而增加1.8%；β-折叠含量增加，β-转角和无规则卷曲含量变化不大。

由以上结果说明，溶液中的溶解氧分子对光照还原metMb有一定的促进作用，当溶液中充满N2时其还原的效率降低；而metMb经光照后，在CO气体存在时更容易被还原，且还原后的蛋白较快的与CO气体结合，形成与CO的复合物MbCO。

3 结 论

本文采用紫外光源对metMb缓冲溶液进行光照实验，结果表明，其在定波长(254 nm)的氙灯光源光照过程中，紫外可见光谱中Soret吸收带409 nm处吸收强度下降并轻微红移，同时在Q带580 nm和544 nm处出现新的吸收峰，且吸收峰面积随着光照时间不断增加。metMb光照后可被还原成Fe（Ⅱ）的中间亚稳态，通过比较Q吸收带580 nm和544 nm处吸收峰面积的变化，在紫外光源的照射下，波长、温度、pH以及气体等外界因素对高铁肌红蛋白的还原均有影响。metMb在定波长254 nm照射，温度为10℃，偏碱性的适宜条件下，对其光还原较有利。根据气体小分子与血红素铁的配位能力不同，可不同程度的催化metMb的还原过程，气体对metMb光照还原有催化作用与Fe2+和气体配位能力有关。通过圆二色光谱表明不同气体存在时光照metMb，其二级结构变化也有相应变化。紫外光照高铁肌红蛋白的还原过程以及气体小分子与Fe（Ⅱ）配位催化还原过程在医学和生理学上具有重要意义。

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Photoreduction of Metmyoglobin by Ultraviolet Irradiation

AN Liang-Mei1CAO Hong-Yu1,2TANG Qian1ZHENG Xue-Fang＊,1,2
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(2Liaoning Key Laboratory of Bio-organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

According to the experiment,we have discovered that the photoreduction procedure of metMb is similar to the chemical reduction course.In this research,the photoreduction induced by direct irradiation in the ultraviolet region was investigated by means of UV-Vis absorption and circular dichroism (CD)spectra.By comparing the changes of new absorption peak area at 580 and 544 nm of the Q band,we observed the reduction extent under different light sources,specific UV fixed wavelengths,temperature,pH values and gas exposure;metMb is reduced to MbFe（Ⅱ）H2O state after the illumination;the alkaline conditions are favored for reduction at 10℃in 254 nm wavelength UV;as the coordination abilities of heme iron with gas molecules differ,the catalytic process of reduction varies under UV irradiation in the presence of gas.CO or O2can facilitate the photoreduction process.These conclusions have a promised significance in medicine and physiology.

metmyoglobin;UV irradiation;photoreduction;UV-Vis absorption spectra;gas molecules

O629.73；O644.1

A

1001-4861(2012)07-1461-08

2011-11-28。收修改稿日期：2012-03-22。

国家自然科学基金(No.20871024)；辽宁省高校创新团队(No.2006T002，2008T005，2009T003)；辽宁省教育厅(No.2009A069，2009A071)和大连市科技计划(No.2008E11SF170)资助项目。

＊通讯联系人。E-mail：dlxfzheng@126.com，Tel：+86-0411-87403720