高糖通过提高ROS水平和钙超载诱导小鼠MC3T3－E1成骨细胞凋亡*

郭宝磊， 杨茂伟， 梁 单， 曹军军， 杨 蕾， 郭晓东

(中国医科大学附属第一医院骨外科，辽宁沈阳110001)

骨质疏松症是以骨形成减少、骨量降低为特征的疾病，目前流行病学调查表明［1］，糖尿病患者的骨量明显降低，而骨折的风险明显增加。糖尿病所导致的骨代谢异常主要表现为骨形成缺陷、成骨细胞数量减少、类骨质形成不足等［2］。研究表明高糖可以引起成骨细胞凋亡［3］，但具体机制目前尚未清楚，本文通过高糖处理成骨细胞系MC3T3-E1细胞后，检测成骨细胞的凋亡情况及细胞内ROS水平和游离Ca2+浓度，初步探讨高糖诱导成骨细胞凋亡的机制。

材料和方法

1 材料

小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自美国培养物保存中心 (ATCC，CRL-2593)，α-MEM培养基购于Gibco，胎牛血清购于 HyClone，MTT、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和膜通透性Ca2+螯合剂1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷 -N，N，N'，N'-四乙酸四(乙酰氧甲基)酯［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'，N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl)ester，BAPTA-AM］购于 Sigma，D-葡萄糖、甘露醇和氯化镧购于国药集团公司，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)购于碧云天公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京赛宝克公司，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、Fura-2/AM 购于Molecular Probes。

2 细胞培养

小鼠MC3T3-E1细胞培养于含10%FBS的α-MEM培养基当中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，0.25%胰酶常规传代。

3 细胞体外生长活性检测

采用 MTT法进行检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，以5×107/L密度接种于96孔板当中(100 μL/well)，培养24、48 h 后，加入不同浓度D-葡萄糖的α-MEM培养基(100 μL/well)，使D- 葡萄糖终浓度为 0、10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L，重复设置6孔。加药作用24和48 h后弃掉培养基，向每孔分别加入20 μL的5 g/L的MTT储存液，并于37℃孵育4 h。吸出MTT后，向每孔加入150 μL的DMSO，酶标仪570 nm波长测定吸光度。按照抑制率(%)=［A570(正常)-A570(加药)］/A570(正常)×100%，计算出半数抑制浓度(IC50)。

4 实验分组

取对数生长期的MC3T3-E1细胞随机分成以下各组:(1)正常对照组(control);(2)高糖组(HG):35 mmol/L D-葡萄糖;(3)高渗对照组(mannitol):加入35 mmol/L甘露醇，用以排除高渗对细胞影响;(4)BAPTA-AM组(HG+BA):加入35 mmol/L葡萄糖和20 μmol/L BAPTA-AM，用于说明钙超载与高糖诱导凋亡之间关系;(5)氯化镧组(HG+La):加入35 mmol/L葡萄糖和20 μmol/L氯化镧，用以说明钙离子是否通过储量操纵性钙通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)释放;(6)NAC 组(HG+NAC):加入35 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L NAC，用以说明ROS升高与与高糖诱导凋亡之间关系。

5 细胞内ROS水平检测

细胞内ROS水平采用DCFH-DA荧光探针进行检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞接种于100 mm培养皿中。在含10%FBS的α-MEM培养基中培养24 h，加入处理药物作用24 h，羰酰氰基对氯苯脘(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)作为阳性对照。使用无血清的α-MEM培养基洗1次后，加入30 μmol/L DCFH-DA 于37℃孵育1 h，每5 min振荡细胞1次。用无血清的α-MEM培养基洗细胞3次后，倒置荧光显微镜检测并分析荧光强度。此外药物处理细胞后，常规消化，DCFH-DA染色后，流式细胞仪(FACSCalibur，Becton-Dickinson)进行检测，CellQuestTM软件 (Becton-Dickinson)分析并计算ROS阳性率。

6 细胞内游离Ca2+水平的检测

细胞内Ca2+水平采用Fura-2/AM荧光探针进行检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，接种于100 mmol/L培养皿中。在含10%FBS的α-MEM培养基中培养24 h后，加入不同处理药物培养24 h。使用D-Hanks液洗细胞3次后，加入20 μmol/L Fura-2/AM于37℃孵育1 h，每5 min振荡细胞1次。用D-Hank's液洗细胞3次后，荧光分光光度计采用340、380 nm双波长检测荧光强度。先检测静息状态下两波长的荧光强度(F340和F380)，荧光最大值由加入为 10%Triton X-100 20 μL 测得(Fmax，340和Fmax，380)，荧光最小值由加入浓度为100 mmol/L的 EGTA 80 μL 测得(Fmin，340和 Fmin，380)，根据［Ca2+］(nmol/L)=Kd× ［(R-Rmin)× Fmin，380］/［(Rmax-R) × Fmax，380］(Kd=240 nmol/L，R=F340/F380，Rmin=Fmin，340/Fmin，380，Rmax=Fmax，340/Fmax，380)。

7 成骨细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI法检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞接种于100 mm培养皿中。在含10%FBS的α-MEM培养基中培养24 h后，加入处理药物作用24 h。离心收集细胞，用冰冻的PBS洗细胞2次。用200 μL binding buffer重悬细胞后，加入10 μL Annexin V，避光4℃ 孵育30 min，再加入 100 μL binding buffer混匀后加入 5 μL PI 染液，避光4℃ 孵育5 min，流式细胞仪检测，分析计算相对细胞凋亡率。(Annexin V)+PI-标记为早期凋亡细胞，(Annexin V)+PI+标记为晚期凋亡及坏死细胞，细胞相对凋亡率(%)=处理组凋亡率/正常组凋亡率×100%。

8 统计学处理

采用SPSS 17.1软件进行统计学分析。数据采用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高糖对MC3T3－E1细胞增殖的抑制

高糖对MC3T3-E1细胞增殖有明显的抑制作用，并呈剂量效应关系，见图1，24和48 h的IC50分别为35.23 mmol/L和37.87 mmol/L。

2 高糖可诱导MC3T3－E1细胞凋亡

高糖处理MC3T3-E1 24 h后可以引起明显凋亡，见图2A。早期凋亡率由(1.58±0.27)%增加至(24.16±3.53)%，细胞总死亡率由(6.03±0.75)%增加至(63.74±4.32)%(P＜0.01 vs正常组)，见图2B，而甘露醇处理组的早期细胞凋亡率和细胞总死亡率与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，见图2。

3 高糖通过提高细胞内ROS水平诱导MC3T3－E1细胞凋亡

Figure 1.Cell proliferation detected by MTT assay after high glucose treatment.±s.n=3.The curves showed doseeffect relationship.The half maximal(50%)inhibitory concentrations were 35.23 mmol/L and 37.87 mmol/L for 24 h and 48 h treatment，respectively.图1 MTT检测高糖对MC3T3－E1细胞增殖的影响

3.1 高糖提高细胞内ROS水平 高糖处理MC3T3-E1细胞24 h后，ROS水平与对照组相比明显升高，荧光波峰向右迁移(图 3B)，ROS阳性率由(10.36±1.30)%升高到(40.52±8.65)%(P＜0.01 vs正常组)(图3C)，ROS荧光强度明显增强(图3A-b)，与阳性对照强度相近(图3A-e)。甘露醇组与正常组细胞内ROS水平无明显差别，见图3A、B、C。NAC处理后，荧光波峰向左侧回移(图3B)，与高糖组相比ROS水平明显下降，为(14.35±2.98)%(P＜0.01 vs高糖组)(图3C)，ROS荧光强度减低(图2A-d)。

Figure 2.The apoptosis of MC3T3-E1 cells detected by Annexin V/PI staining after high glucose treatment.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.图2 高糖诱导MC3T3－E1细胞凋亡

Figure 3.High glucose induced an increase in ROS that triggered apoptosis in MC3T3-E1 cells.A:DCFH-DA fluorescent staining of the cells(×200).a:control group;b:high glucose(HG)treatment group;c:mannitol treatment group;d:HG+NAC treatment group;e:positive control group.B:flow cytometry analysis of the cells stained with DCFH-DA.C:quantified ROS level of the cells in different groups.D:cell death analysis in different groups.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs;##P＜0.01 vs HG.图3 高糖通过提高细胞内ROS水平引起MC3T3－E1细胞凋亡

3.2 高糖通过提高细胞内ROS水平诱导MC3T3-E1细胞凋亡 加入抗氧化剂NAC后，与高糖组相比，成骨细胞早期细胞凋亡率和总细胞死亡率明显下降(P＜0.01)，与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，见图3D。

4 高糖处理后可引起钙超载

4.1 高糖提高细胞内Ca2+水平增加 高糖处理MC3T3-E1细胞24 h后，细胞内Ca2+水平与对照组相比明显升高，由(226.37±21.38)nmol/L升高至(538.29±22.74)nmol/L(P＜0.01 vs正常组)，见图4A。BAPTA-AM和La3+处理后，细胞内Ca2+离子水平明显下降，分别为(237.86±22.73)nmol/L和(251.86±20.95)nmol/L(P＜0.01 vs高糖组)，见图4A。

4.2 高糖通过提高细胞内ROS水平引起细胞凋亡加入抗氧化剂NAC后，成骨细胞早期细胞凋亡率和细胞总死亡率明显下降(P＜0.01)，与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，见图4B。

5 高糖处理后成骨细胞内ROS与Ca2+水平的关系

5.1 抑制高糖所引起的成骨细胞内ROS水平的提高可以降低细胞内Ca2+水平 加入抗氧化剂NAC后，成骨细胞内Ca2+浓度明显下降(P＜0.01)，与正常组相比无明显差异(P＞0.05)，见图5A。

5.2 抑制高糖所引起的成骨细胞内Ca2+水平的提高可以降低细胞内ROS水平 BAPTA-AM和La3+处理后，成骨细胞内ROS浓度明显下降(P＜0.01)，与正常组相比无明显差别(P＞0.05)，见图5B。

讨 论

骨质疏松症是指单位体积骨量减少伴有骨强度降低，主要与骨吸收和骨形成的动态平衡破坏相关。其中骨的形成和吸收分别由成骨细胞和破骨细胞完成［4］。成骨细胞的数量和活性决定了骨形成水平，从而影响骨量。凋亡作为细胞生理、病理的最终阶段，在骨质疏松当中起到了重要的作用。成骨细胞凋亡的增加导致成骨细胞数量减少，骨形成水平降低，骨量减少［5］。

Figure 4.High glucose induced an increase in［Ca2+］ithat triggered apoptosis of MC3T3-E1 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG.图4 高糖通过提高细胞内Ca2+水平引起MC3T3－E1细胞凋亡

Figure 5.The interaction of ROS and Ca2+after high glucose treatment.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HG.图5 高糖处理后成骨细胞内ROS与Ca2+水平变化

骨质疏松症和糖尿病是目前常见的两种疾病。流行病学调查表明，糖尿病患者的骨量明显降低，骨折的风险明显增加［1-2］。高糖可以通过多种途径诱导细胞凋亡［6］，我们研究发现经过高糖处理的成骨细胞凋亡明显增加，这与Zalavras等［7］的研究一致。

高浓度的细胞内Ca2+可以引起多种细胞凋亡［8］。我们的研究发现高糖处理后可以引起成骨细胞内Ca2+浓度升高。使用Ca2+螯合剂BAPTA-AM降低细胞内Ca2+浓度后，细胞凋亡明显降低。而这种Ca2+增加可被SOCC抑制剂La3+阻断，这说明了高糖所引起的细胞内Ca2+水平升高可能是通过SOCC的开放引起。SOCC是位于细胞质膜和内质网膜上Ca2+通道，当外界因素刺激后，SOCC开放，可以引起细胞外以及内质网内Ca2+释放，从而引起细胞内Ca2+水平升高［9］。通过抑制SOCC降低细胞内Ca2+水平，可以抑制高糖所引起的成骨细胞凋亡，说明了高糖可以使SOCC开放，引起细胞内Ca2+增加，从而导致成骨细胞凋亡。

ROS能够诱导细胞内Ca2+浓度增加［10］。另一方面，增加的细胞内Ca2+可以促进ROS产生［11］。本研究显示预处理BAPTA-AM和La3+降低了高糖所引起的成骨细胞内ROS的产生，同时细胞内Ca2+增加亦能被预处理的NAC所阻断，表明高糖诱导的ROS产生可以引起细胞内钙离子增加。但是高糖诱导ROS产生、增加Ca2+内流的潜在机制仍然不清楚。ROS已知可以与多种离子转运蛋白相互作用［12］，例如Ca2+通道。ROS诱导离子转运体改变的具体机制，包括了可以氧化定位在离子转运体蛋白上的巯基基团、过氧化膜脂质、抑制膜结合的调节酶类等［13-14］。因此，高糖诱导细胞内钙离子增加可能与钙离子通道所通过的膜被ROS脂质过氧化有关。

总之，本研究表明，高糖可以通过开放细胞膜上的SOCC，促进胞外Ca2+内流，造成成骨细胞内钙超载，Ca2+与ROS相互促进，并进一步加剧了钙超载，引起成骨细胞凋亡。

［1］ Räkel A，Sheehy O，Rahme E，et al.Osteoporosis among patients with type 1 and type 2 diabetes［J］.Diabetes Metab，2008，34(3):193-205.

［2］ Hofbauer LC，Brueck CC，Singh SK，et al.Osteoporosis in patients with diabetes mellitus［J］.J Bone Miner Res，2007，22(9):1317-1328.

［3］ de Paula FJ，Horowitz MC，Rosen CJ.Novel insights into the relationship between diabetes and osteoporosis［J］.Diabetes Metab Res Rev，2010，26(8):622-630.

［4］ Reeve J，Hesp R，Wootton R.A new tracer method for the calculation of rates of bone formation and breakdown in osteoporosis and other generalised skeletal disorders［J］.Calcif Tissue Res，1976，22(2):191-206.

［5］ Armour KJ，Armour KE，van't Hof RJ，et al.Activation of the inducible nitric oxide synthase pathway contributes to inflammation-induced osteoporosis by suppressing bone formation and causing osteoblast apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2001，44(12):2790-2796.

［6］ 王晓华，魏亚明，章喜明，等.SeO2诱导白血病细胞凋亡过程中对细胞内活性氧和 Ca2+水平影响［J］.中国病理生理杂志，2005，21(7):1349-1352.

［7］ Zalavras C，Shah S，Birnbaum MJ，et al.Role of apoptosis in glucocorticoid-induced osteoporosis and osteonecrosis［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2003，13(2-4):221-235.

［8］ 王红祥，赵 湜，李宾公，等.高糖对糖尿病患者内皮祖细胞增殖凋亡的影响及其机制探讨［J］.中国病理生理杂志，2007，23(11):2210-2213.

［9］ Liu X，Ambudkar IS.Characteristics of a store-operated calcium-permeable channel:sarcoendoplasmic reticulum calcium pump function controls channel gating［J］.J Biol Chem，2001，276(32):29891-29898.

［10］ Ngoh GA，Watson LJ，Facundo HT，et al.Augmented O-GlcNAc signaling attenuates oxidative stress and calcium overload in cardiomyocytes［J］.Amino Acids，2011，40(3):895-911.

［11］ Carraway MS，Suliman HB，Madden MC，et al.Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells［J］.Free Radic Biol Med，2006，41(11):1662-1669.

［12］ Tajima S，Tsuchiya K，Horinouchi Y，et al.Effect of angiotensin II on iron-transporting protein expression and subsequent intracellular labile iron concentration in human glomerular endothelial cells［J］.Hypertens Res，2010，33(7):713-721.

［13］ Schreck C，O'Connor PM.NAD(P)H oxidase and renal epithelial ion transport［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(5):R1023-R1029.

［14］ Scarfì S，Magnone M，Ferraris C，et al.Ascorbic acid pre-treated quartz stimulates TNF-α release in RAW 264.7 murine macrophages through ROS production and membrane lipid peroxidation［J］.Respir Res，2009，10:25.