高水溶性铂类抗肿瘤药物的设计与合成

张启飞 鲁彦会 刘朋兴 王松青 高清志

天津大学药物科学与技术学院 天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津 300072

铂类抗癌药是肿瘤治疗领域具有代表性的一类药物。目前世界上广泛应用于临床治疗的具有代表性的铂类抗癌药主要有顺铂、卡铂和奥沙利铂[1-2]。自1978年美国FDA批准顺铂作为抗肿瘤药上市以来对它的作用机制的研究已经非常透彻，这也带动了铂类有机金属化合物在肿瘤医学领域的应用和发展，为设计和开发具有新的分子结构的铂类抗肿瘤药物奠定了基础[3]。

铂类抗癌药物的致命缺点是具有极强的毒副作用以及固有的和后续形成的耐药性问题。另外由于此类药物是金属有机化合物，所有铂类上市药物普遍存在水溶性极低的特性，给药品制剂的稳定性和临床应用带来了很多的不利影响，比如很难把这些难溶性药物顺利地配制成一种方便合适的剂型。继顺铂之后开发成功的卡铂（美国BMS开发）由于从结构上降低了药物对DNA的反应性，临床应用近年逐步扩大，有取代顺铂各种临床应用的趋势。但是，卡铂并没有从根本上解决顺铂存在的耐药性问题，也没有从根本上改变药物的水溶性问题，很难避免药物存在的致命缺点：严重的肾毒性副作用以及临床制剂的稳定性问题[4]。奥沙利铂虽然在某种程度上降低了顺铂和卡铂存在的耐药性问题，但其在针对多种肿瘤的临床应用中并没有超越顺铂和卡铂的治疗效果，也没有从根本上解决铂类药物极强的毒副作用和极低的水溶性问题。铂类药物的水溶性不仅直接关系到药物的制剂工艺和临床应用，还直接影响到铂类药物的药效学及毒理特征。增加药物的水溶性一方面可以延缓药物被水解的速度，提高半衰期，另一方面水溶性高的铂类化合物可以有效地被肾脏排出，减少此类药物对肾脏的毒副作用[5]。本文采用糖分子偶联方法设计与合成了具有极高水溶性的新型铂类抗肿瘤化合物，其水溶性与顺铂相比提高了600 倍并在初步的动物模型抗肿瘤试验中显示了优于顺铂和卡铂的药效以及药物安全性。

1 目标化合物的设计及合成路线

1.1 目标化合物的设计

本文选用常见的葡萄糖作为载体，通过1-位活泼的羟基连接侧链后，再与丙二酸铂环己二胺络合物进行偶联得到含糖分子结构的铂类抗肿瘤化合物（图1）。利用糖分子结构的高水溶性特点提高铂类化合物的溶解度，进而实现降低药物毒副作用的目的。

1.2 目标化合物的合成路线

本文所采用的制备方法是将卤代醇先与葡萄糖在路易斯酸存在下进行缩合，然后进行与丙二酸酯衍生物的取代反应，接下来进行水解，最后在碱性条件下与环己二胺硫酸铂络合物进行反应得到目标化合物。合成路线见图2。本制备路线中涉及在路易斯酸存在下的葡萄糖苷合成反应、葡萄糖的乙酰化、丙二酸酯的2-位取代反应以及最后的脱保护反应[6-7]。

2 合成方法及结果

核磁共振氢谱用德国Brucker AC-400 型核磁共振波谱仪测定。质谱采用Agilent 6310 Ion Trap LC/MS液质联用仪测定。

2.1 1-O-D-葡萄糖苷-2-溴-乙烷的制备

在室温条件下将葡萄糖（2.7 g）加入到2-溴乙醇（10 mL）中，冷却到0℃后用氮气置换烧瓶内空气，在氮气保护下慢慢滴加三氟化硼的乙醚溶液（98%，1 mL）。将反应液在0℃搅拌15min，然后慢慢升温到室温并搅拌30 min，然后将反应液加热到80℃，在80℃反应5h。反应完成后，旋蒸除去溶剂，使用硅胶柱色谱（二氯甲烷∶甲醇=6∶1）对反应生成物实施简单纯化，得到粗产品 2.3 g。 质谱：MS，m/z：287.23[M+1]+。

2.2 1-O-（2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄糖苷）-2-溴-乙烷的制备[7-8]

在室温条件下，将“2.1”项下反应得到的产品1-O-D-葡萄糖苷-2-溴-乙烷2.3 g溶解于吡啶与乙酸酐 （7 mL∶7 mL）中，搅拌过夜，用薄层色谱法（TLC）监测反应终点。反应完成后，加入100 mL乙酸乙酯，用体积浓度为5%的盐酸水溶液（25mL，2 次）洗涤，将水相用乙酸乙酯（25mL，2 次）萃取，合并有机相。将有机相依次用饱和氯化铵水溶液（100 mL，1次），蒸馏水（100 mL，1 次），饱和碳酸氢钠水溶液（100 mL，1 次），饱和氯化钠水溶液（100 mL，1次）洗涤，用无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪将溶剂蒸干，得到微黄色粗产品。得到的粗产品经硅胶柱色谱纯化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到无色油状目的产物 3.5g，两步收率为 51.3%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3），δ 5.45（1H，t，J=9.6 Hz），5.15（1H，d，J=4 Hz），5.02（1H，t，J=9.6 Hz），4.80～4.83 （1H，m），4.19～4.23 （1H，m），4.04～4.15（2H，m），3.92～4.00（1H，m），3.75～3.85（1H，m），3.49（2H，t，J=6 Hz），1.91～2.11（12H，m）。 质谱：MS，m/z：455.15[M+1]+

2.3 1-O-（2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄糖苷）-丙烷-3，3-二甲酸二乙酯的制备[9-10]

将“2.2”项下反应得到的产品 1-O-（2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄糖苷）-2-溴-乙烷（2.5g）溶解于 5mL 干燥的 N，N-二甲基甲酰胺中，向反应液中加入碳酸钾（3 g）及丙二酸二乙酯（1.76 g），室温搅拌过夜。用TLC监测反应终点，待反应完成后，向反应液中加入100 mL乙酸乙酯，然后用饱和氯化铵水溶液（50 mL，1次）洗涤，将水相用乙酸乙酯萃取（25mL，2次），合并有机相。将有机相依次用饱和氯化铵水溶液（100 mL，1 次），蒸馏水（100 mL，1 次），饱和氯化钠溶液（100 mL，1次）洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，用旋转蒸发仪将溶剂蒸干，得到的淡黄色油状物用硅胶柱色谱纯化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到无色透明油状目的产物2.6 g，收率为88.5%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3），δ 5.42（1H，t，J=9.6 Hz），4.96～5.10（2H，m），4.78～4.90（1H，m），4.03～4.33（5H，m），3.92～4.02（1H，m），3.71～3.87（1H，m），3.71～3.87（1H，m），3.55（1H，t，J=8 Hz），3.40～3.50（1H，m），2.13～2.28（2H，m），1.94～2.14（12H，m），1.15～1.35（6H，m）。 质谱：MS，m/z：535.34[M+1]+

2.4 1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸的制备[11-12]

将 1-O-（2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄糖苷）-丙烷-3，3-二甲酸二乙酯（2.6 g，）溶解于5mL甲醇中。将氢氧化钠（1.6 g）溶解于10 mL水中，室温下加入到反应液中，然后升温至60℃反应24 h。用TLC监测反应终点。待反应完成后，用旋转蒸发仪除去甲醇，使用强酸性阳离子交换树脂处理产品。将过滤得到的水溶液用冷冻干燥机干燥后得到无色黏稠状液体1.3 g，粗产品直接用于下步反应。质谱：MS，m/z：311.25[M+1]+。

2.5 顺-[反式-（1R，2R）-二氨基环己烷]铂（Ⅱ）（1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸酯）的制备[13-14]

将 1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸粗产品（1.3 g）溶解于15mL水中，加入八水合氢氧化钡1.3 g，在氮气保护下将环己二胺硫酸铂（1.7 g）溶解于2 mL水中，加入到上述反应液中，反应在室温避光搅拌过夜。待反应完成后，使用离心机除去沉淀，收集上清液，使用冷冻干燥机冻干，用半制备高压液相色谱分离得到1.5g最终产品，两步反应总收率为51.9%，白色固体。1H-NMR（400 MHz，D2O），δ 4.80（0.8H，d，J=3.6 Hz），4.25（0.2H，d，J=7.2 Hz），4.18（1H，m），3.12～3.90（8H，m），2.30～2.45（2H，m），2.20～2.30（2H，m），1.82～1.96（2H，m），1.44（2H，d，J=9.6 Hz），1.15～1.24（2H，m），0.95～1.15（2H，m），质谱：MS，m/z：618.36[M+1]+。

2.6 水中饱和溶液溶质质量测定结果

为了比较本研究中糖分子偶联后铂类抗肿瘤化合物与上市药物顺铂、卡铂以及奥沙利铂在水溶性方面的不同，本研究分别针对所取得的化合物以及上述3 种上市药物进行了室温下药物的在水中饱和溶液溶质质量测定。

结果表明，本研究中糖分子偶联后铂类抗肿瘤化合物在水中的溶解度大于600 mg/mL，与最具代表性的临床药物顺铂（1 mg/mL）、卡铂（17 mg/mL）以及奥沙利铂（6 mg/mL）相比其水溶性得到了非常显著的提高。根据笔者的文献调查，取得具有如此高水溶性的有机铂类抗肿瘤化合物，本研究属于首次。

2.7 糖分子偶联铂配合物动物模型抗肿瘤药效实验结果

在下述试验中，试验用动物为8～9周龄的雌性CDF1 种鼠，动物体重为20～25g。用L1210 细胞（每只动物约105个细胞）由腹膜内接种，本研究所得化合物以及临床药物顺铂以及卡铂在动物模型抗肿瘤试验中的药效结果见表1。对于本研究中取得的糖分子偶联铂类抗肿瘤化合物和卡铂，使用5%甘露糖醇水溶液（V/V），对于顺铂则使用5%甘露糖醇生理盐水溶液（V/V）。在肿瘤细胞移植后第1、4 天经由腹腔内注射药物，每组实验动物数目为6。

动物寿命延长（ILS）的计算方法如下：

ILS（%）=[（St/Su）-1]×100%

其中，St=接受治疗的动物存活日的加权中间数；Su=未接受治疗的动物存活日的加权中间数。

表1 糖分子偶联铂配合物动物模型抗肿瘤药效实验结果

表1 结果显示，本研究中所取得的高水溶性糖分子偶联铂类抗肿瘤化合物在上述动物试验中取得了安全性和抗肿瘤药效均优于临床药物顺铂和卡铂的结果。本研究化合物最小剂量组（50.0 mg/kg，相当于0.08 mmol金属铂）与卡铂最大剂量组（80.0 mg/kg，相当于0.20 mmol金属铂）以及顺铂最大剂量组（5.0 mg/kg，相当于0.02 mmol金属铂）比较，药效均显著。在药物的安全性方面，本研究初步实验结果显示，本文所制得化合物不论在动物体重变化以及第42 天动物残存数量上都优于临床药物顺铂和卡铂。

3 讨论

本研究为了设计与合成具有高水溶性的铂类抗肿瘤药物，通过在丙二酸铂结构中偶联糖分子设计出目标化合物并合成取得水溶性抗肿瘤药物。结果得到了迄今水溶性最好的金属铂类抗肿瘤化合物，其动物模型抗肿瘤活性和安全性均优于顺铂和卡铂。提示通过糖分子偶联设计取得的新型铂类抗肿瘤药物能够解决一般铂类药物的低水溶性问题，经初步动物模型抗肿瘤药效实验证明该类药物具有理想的抗肿瘤效果。

[1] Tromp RA，Van BS，Marco TC，et al.The β-glucuronyl-based prodrug strategy allows for its application on β-glucuronyl-platinum conjugates[J].Bioorg Med Chem Lett，2004，14（16）：4273-4276.

[2] Medina RA，Owen GI.Glucose transporters：expression，regulation and cancer[J].Biol Res，2002，35（1）：9-26.

[3] Rosenberg B，Van CL，Krigas T.Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode[J].Nature，1965，205（4972）：698-699.

[4] Canetta R，Rozencweig M，Carter SK.Carboplatin：the clinical spectrum to date[J].Cancer Treat Rev，1985，12：125-136.

[5] Galanski M，Keppler BK.Searching for the Magic Bullet：Anticancer Platinum Drugs Which Can Be Accumulated or Activated in the Tumor Tissue[J].Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry，2007，7：55-73.

[6] Likhosherstov LM，Novikova OS，Shibaev VN.New Synthesis of β-Glycosylamines of D-Mannose，2-and 6-Deoxysugars，and D-Glucuronic Acid with the Use of Ammonium Carbamate[J].Doklady Chemistry，2003，389：4-6.

[7] Muhizi H，Grelier S，Coma V.Synthesis and antibacterial activity of aminodeoxyglucose derivatives against listeria and salmonella typhimurium[J].J Agric Food Chem，2009，57：8770-8775.

[8] Green DE，Ferreira CL，Stick RV，et al.Carbohydrate-Bearing 3-Hydroxy-4-pyridinonato Complexes of Gallium（Ⅲ）and Indium（Ⅲ）[J].Bioconjugate Chem，2005，16：1597-1609.

[9] Yang J，Fu X，Jia Q，et al.Studies on the Substrate Specificity of Escherichia coli Galactokinase[J].Org Lett，2003，5（3）：2223-2226.

[10] Fort S，Boyer V，Greffe L，et al.Highly Efficient Synthesis of（1-4）-Oligo-and-Polysaccharides Using a Mutant Cellulase[J].J Am Chem Soc，2000，122：5429-5437.

[11] 徐云根，姚硕蔚，尤启冬，等.氨基糖衍生物，其制法及其医药用途：中国，CN 101591364A[P].2009-12-02.

[12] Miiller S，Schliiter AD.Synthesis of Water-Soluble，Mu ltiple Functionalizable Dendrons for the Conversion of Large Dendrimers or Other Molecular Objects into Potential Drug Carriers[J].Chem Eur J，2005，11：5589-5610.

[13] Isaad J，Rolla M，Bianchini R.Synthesis of water-soluble large naturalized Dyes through double glycoconjugation[J].Eur J Org Chem，2009，1：2748-2764.

[14] Matsuda K，Tsuchiya T，Torii1 T，et al.Synthesis of 6-amino-6-deoxy-L-idopyranosides [J].Bull Chem Soc Jpn，1986，59：1397-1401.