灯盏花素片中灯盏乙素含量的HPLC法测定

邵 鑫，周 洁，姚 武

（1.黄山职业技术学院，安徽黄山245000；2.黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）

灯盏花素片中灯盏乙素含量的HPLC法测定

邵 鑫1，周 洁2，姚 武2

（1.黄山职业技术学院，安徽黄山245000；2.黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）

灯盏乙素是从中药灯盏花中提取的黄酮类有效成分。用HPLC法测定灯盏花素片中灯盏乙素的含量，采用C8反相柱，流动相为乙腈∶水∶醋酸∶2%磷酸=20∶77.5∶2.0∶0.5（V/V）的混合溶液，流速1.2ml/min，检测波长335nm。该方法在0.03-0.24μg的范围内具有良好的线性关系，平均回收率为98.05%，相对标准偏差是1.9%。此方法快速、简便，准确，可用于灯盏乙素的含量测定。

灯盏花素片；灯盏乙素；高效液相色谱法

灯盏花素片是灯盏花中提取的黄酮类有效成分制成的片剂，其主要有效成分为灯盏乙素(Seutellarin)，主要用于治疗高血压、脑栓塞等疾病。为了提高药物的生物利用度，最大限度发挥药效，需要建立准确可靠的检测方法来控制产品质量、满足临床研究及药代动力学研究的需要。灯盏乙素的定量测定方法，已有不少报道。比如用LC/MS/MS方法[1]定量测定，此种方法定性定量准确、灵敏度高，但需三级四级杆串联质谱作为HPLC的检测器，仪器昂贵无法推广。有文献报道了以甲醇、水、乙酸混合液作为流动相的HPLC方法，[2,3]但该方法保留时间较长，导致分析时间也较长。另有文献以乙腈、水、乙酸为流动相，[4,5]改善了分离效果，保留时间缩短。本文探索了以乙腈+水+醋酸+磷酸为流动相，测定灯盏花素片中灯盏乙素的含量。实验证明在最佳条件下，保留时间进一步缩短，且峰形良好，灵敏度进一步提高，得到了类似串联质谱检测器的效果，实现了对灯盏乙素的简便、快速、准确测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪（四元泵，C8反相柱，六通阀进样器，紫外可见光度检测器，色谱工作站）。AL104型电子天平（上海天达仪器有限公司），SYC智能超级恒温水槽（巩义市英峪予华仪器厂），KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）。

灯盏花素片（云南玉溪望子隆生物制药有限公司），呈黄棕色。灯盏乙素标准品（上海融禾医药科技有限公司，纯度>98%）。甲醇、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯。

1.2 实验方法和色谱条件

取一定量的灯盏花素片于研钵中研成粉末，准确称量100mg样品，至于小烧杯中，加入甲醇适量溶解，超声20min，冷至室温，转移至25mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀后微孔滤膜抽滤，回收滤液待用。

色谱条件：C8反相柱（4.6mm×150mm,5μm）；流动相为乙腈∶水∶醋酸∶2%磷酸=20∶77.5∶2∶0.5（V/V）；流速：1.2mL/min；检测波长为335nm。灯盏乙素对照品和灯盏花素片试液的色谱曲线如图1。

图1 灯盏乙素标准品(A)和灯盏花素片(B)的HPLC曲线

2 结果与讨论

2.1 线性关系考查

称取20mg灯盏乙素对照品用甲醇溶解定容为25mL，再稀释50倍，得到准确浓度的标准溶液，在上述色谱条件下依次进样2、5、10、15、20μL。以灯盏乙素进样量X（μg）与峰面积Y作线性回归，得灯盏乙素进样量X（μg）及峰面积Y的回归方程为Y=351.9X+8.110，相关系数为r=0.9981，表明灯盏乙素在0.032μg-0.32μg间进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 精密度实验

连续对同一灯盏花素片样品进行5次平行测定，测定结果的相对偏标准差RSD=0.51%，可见方法精密度良好。

2.3 回收率实验

在已知灯盏乙素含量的灯盏花素片样品中准确加入一定量的灯盏乙素标样，按上述色谱条件进样，平行测定5次，平均回收率为98.05%，相对标准偏差（RSD）为1.9%，结果见表1。

表1 回收率实验数据

2.4 稳定性实验

灯盏花素片稳定性实验是将灯盏花素片按实验方法超声处理后，定容至25ml，取2ml稀释到100ml，用0.45μm微孔滤膜过滤，所得滤液在室温自然光下分别放置0h，1h，2h，14h，17h，31h后在相同色谱条件下进样10μL进行测量，结果见表2，相对标准偏差为2.0%，说明方法稳定性良好。

表2 稳定性实验结果

2.5 样品测定

为25mL的样品液2mL，分别都用甲醇稀释到100mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进样10μL，计算样品中灯盏乙素的含量，结果见表3。

表3 灯盏花素片中灯盏乙素的含量（n=3）

3 结论

通过配制一定浓度的灯盏乙素对照品，用紫外分光光度计在220nm-500nm范围进行光谱扫描，结果灯盏乙素在335nm处有最大吸收，所以紫外检测器的波长选为335nm。

本文实验采用流动相为乙腈∶水∶醋酸∶2%磷酸=20∶77.5∶2∶0.5（V/V），结果灯盏乙素对照品和灯盏花素片样品在2.2min处均出现特征峰，与其它文献比较，保留时间更短，提高了分析测定的速度，分析灵敏度也进一步提高。同时，灯盏花素片中的其它成分对测定没有影响，证明此方法对灯盏乙素具有很好的专属性。

[1]曲峻，王义明，罗国安，等.LC/MS/MS的多反应监测方法定量测定灯盏乙素[J].药学学报，2000，35(2):139-141.

[2]冯绍华，杨振乾，张静.HPLC法测定灯盏花素片中灯盏花乙素的含量，中国药品标准，2005，6（5）：29-31.

[3]Xiong F,Wang H,Cheng J,Zhu J B.Determination of scutellarin in mouse plasma and different tissues by high-performance liquid chromatography.Journal of Chromatography B,2006,835(1,2):114-118.

[4]李廷钊，周萍，刘文庸，等.HPLC法测定灯盏细辛中灯盏花乙素的含量[J].中草药，2004，35(11):1304-1305.

[5]王跃飞，潘桂湘，高秀梅，等.HPLC法同时测定不同产地灯盏细辛中4种有效成分的含量[J].药物分析杂志，2009，29(3)：416-419.

责任编辑：胡德明

Abstract:Breviscapine is an active extract of flavonoids from traditional Chinese medicine Erigeron breviscapus(Vant.).An HPLC method for the determination of seutellarin in beviscapine tablets is reported.The sample is analyzed on a C8 column with a mobile phase containing acetonitrile(20%),water(77.5%),HAc(2%)and 2%H3PO4(0.5%).The flow rate and detection wavelength are 1.2 mL/min and 335 nm respectively.The calibration curve shows a good linearity within the range of 0.03-0.24μg.The average recovery is 98.05%and RSD is 1.9%.Being simple,rapid and accurate,this method can be used in the quantitative determination of scutellarin.

Key Words:breviscapine tablet;scutellarin;HPLC

Determination of Scutellarin in Breviscapine Tablets by HPLC

Shao Xin1,Zhou Jie2,Yao Wu2
(1.Huangshan Vocational College,Huangshan245000,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Huangshan University,Huangshan245041,China)

O657

A

1672-447X（2012）03-0053-002

2012-01-20

安徽省自然科学基金项目（11040606M41）；安徽省教育厅自然科学研究项目（KJ2010B215）；黄山学院博士人才启动项目（2009xkjq001）

邵鑫（1965-），安徽黄山人，黄山职业技术学院高级讲师，研究方向为植物资源有效成分。