段 秀,张玉锋,庄永亮
(昆明理工大学化学工程学院食品科学研究中心,云南昆明650500)
食源性血管紧张素转化酶抑制肽研究进展
段 秀,张玉锋,庄永亮*
(昆明理工大学化学工程学院食品科学研究中心,云南昆明650500)
肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)在血压调节方面是一对相互拮抗的体系,其平衡失调被认为是高血压发病的一个重要因素,而血管紧张素转化酶(ACE)是影响两体系的关键。食物来源的ACE抑制肽因具有安全性好、成本低、易吸收、降压明显等优点,越来越受到人们的关注。本文详尽阐述了ACE抑制肽的降压机制、来源、生物利用率、结构与活性关系、分离纯化方法、活性测定与功能评价及其应用前景。
高血压,ACE,ACE抑制肽
Abstract:Renin-angiotensin system(RAS) and kallikrein kinin system(KKS) is a pair of mutually antagonistic system in blood pressure regulation,dissonance of which is considered to be an important factor in the pathogenesis of hypertension,and angiotensin converting enzyme(ACE) is a critical factor affecting the systems.More and more attentions have been paid to the food-derived ACE inhibitory peptides,because of their higher activity of inhibiting ACE,good security,low cost,easy to absorb and obvious antihypertension.In this review,the antihypertensive mechanism,sources,bioavailability,structure-activity relationships,separation and purification methods,activity measurement,functional assessment of ACE inhibitory peptides,and its application prospects were introduced.
Key words:hypertension;ACE;ACE inhibitory peptide
高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症,是威胁人类健康的主要疾病之一。因其与脑中风、心力衰竭和冠心病等一系列心脑血管疾病高度关联而引起人们高度关注[1]。随着人们生活水平大幅提高,无论在发达国家还是发展中国家,高血压疾病发生率都很高。资料表明,高血压平均发病率为10%~20%,全球每年因高血压死亡人数达1200万[2];在我国高血压患者也已超过1.6亿[3]。目前用于临床治疗高血压和心脏衰竭的合成ACE抑制剂已有许多,如卡托普利、依那普利、赖诺普利和雷米普利。但是,这些药物可能产生低血压、钾水平上升、肾功能降低、咳嗽、味觉异常等副作用。食物蛋白来源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得,食用安全性高,无毒副作用,对高血压患者可以起到降压作用而对血压正常者无降压作用,同时还具有免疫调节、减肥和易消化吸收等功能,有着合成化学药物不可比拟的优越性[1]。本文综述了ACE抑制肽的来源、分离纯化方法及ACE抑制肽的结构与活性的关系,旨在为其开发利用提供参考。
国内外研究表明,ACE抑制肽的作用机制如图1所示。从图1中可看出,肾素-血管紧张素系统(RAS)开始于无活性的先导物血管紧张素原,肾素可使血管紧张素原释放出血管紧张素Ⅰ,在血管紧张素转换(ACE)作用下,血管紧张素-Ⅰ失去C-端二肽形成血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ是一种血管收缩剂,增加周围血管阻力,且刺激醛固酮的合成和释放,醛固酮促进远曲小管和集合管对Na、水的重吸收使血压增加,两者共同作用导致血压上升[4]。ACE是一个多功能的酶也涉及KKS,激肽释放酶催化激肽原形成缓激肽,缓激肽通过增加前列腺素和NO,使血管扩张,降低周围血管阻力,从而使血压下降[5],ACE能去除具有扩血管作用的缓激肽C-末端的二肽,导致形成无效片段[6]。
图1 肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统Fig.1 Renin-angiotensin and Kallikenin-kinin system
从食物来源上来看,ACE抑制肽主要来源于乳蛋白,动、植物蛋白和发酵食品[7]。大豆、乳品和水产品是公认的优质蛋白源,且资源丰富,可作为提取ACE抑制肽原料,目前采用最多的是从牛奶蛋白中提取ACE抑制肽[8]。
乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白,而牛奶蛋白由80%酪蛋白和20%的乳清蛋白组成,是优质的乳蛋白来源。在牛奶中发现的主要酪蛋白组分是αS1-,αS2-,β-和κ-酪蛋白(分别为45.0%、12.0%、35.0%和8.0%),主要的乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白和阮-胨[1]。Jiang等[9]从牛乳酪蛋白的酶解物中分离出两种ACE抑制肽RYPSYG(κ-酪蛋白酶;f25~30)和DERF(κ-酪蛋白酶;f15~18),IC50值分别为65.71、37.08μmol/L,并且能显著降低原发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)的血管收缩压。Pan等[10]从乳清蛋白酶解物中分离出一种新的ACE抑制肽,RLSFNP(β-乳球蛋白(f148~153)),该肽的IC50值为177.39μmol/L。此外,他们还用胰蛋白酶水解浓缩乳清蛋白(WPC-80),从中分离出ACE抑制肽LL,并且用分子对接计算研究了LL/ACE的相互作用[11]。Bidasolo等[12]从驴奶的复合酶解物中分离出ACE抑制肽VAPFPQPVVP[β-酪蛋白f(176-185)],该肽的IC50值为48.8μmol/L,这是第一次报道从驴奶中获得的活性肽。
鱼蛋白质是仅次于牛奶蛋白的第二大ACE抑制肽来源,很多研究均表明从鱼肉、虾、蟹等水产动物蛋白中制得的酶解降血压肽其降压活性要优于其他食物性蛋白来源[13]。Chen等[14]从草鱼蛋白酶解物中分离出一个高ACE抑制活性的三肽VAP,该肽为竞争性抑制剂,且对消化酶稳定,这是第一次报道食源性的VAP。F HASAN等[15]研究了合成肽肽A(PNRIKYGD)和肽B(HERDPTHIKWGD)在肠道环境下的消化过程,并且发现IK+芳香族氨基酸可能是某些ACE抑制肽重要的功能部分。另外,对酶解鱼类的加工副产物(如鱼皮,鱼骨)中的ACE抑制肽的研究也有很多,如Lee等[16]用胃蛋白酶水解金枪鱼骨,从中分离出一个含21个氨基酸的ACE抑制肽IC50为11.28μmol/L,进一步研究发现口服该肽可以显著降低SHR的收缩压。Lee等[17]用多种蛋白酶水解鳐鱼皮,发现α-糜蛋白酶水解物具有最高的ACE抑制活性,并从中分离出两种ACE抑制肽:PGPLGLTGP和QLGFLGPR,它们的IC50值分别为95μmol/L和148μmol/L。
表1 鱼蛋白来源的ACE抑制肽举例Table 1 Examples of ACE inhibitory peptides derived from fish protein
表2 植物蛋白来源的ACE抑制肽举例Table 2 Examples of ACE inhibitory peptides derived from plant protein
植物蛋白来源的ACE抑制肽其成本低,提取和纯化较方便,用常规分离纯化法即可获得高纯度的肽。目前植物蛋白肽来源的研究主要集中在大豆、玉米、花生、油菜籽等农作物[20]。M Kuba等[21]从β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的酶解物得到LAI PVNKP、LPHF、SPYP和WL四种降血压肽,IC50值分别为70、670、850、65μmol/L,体外消化后发现SPYP和WL的活性得到保留,且SPYP的活性显著增强。Lin等[22]酶解玉米加工副产物,分离纯化得到降血压肽AY,并且发现低分子量玉米肽喂食SHR,降血压效果好。Jimsheena等[23]发现花生球蛋白的胃蛋白酶解物的水解度最高,且ACE抑制作用最强。Yuko Yamada等[24]用酶水解油菜籽,从中分离出降血压肽RIY,命名为rapakinin,在原发性高血压大鼠(SHR)肠系膜动脉以血管内皮细胞依赖性形式表现出舒张活性(EC50=5.1μmol/L),并且发现浓度为10mol/L的rapakinin通过PGI2-IP受体,其次是CCK-CCK1受体途径舒缓肠系膜动脉。SHR口服15mg/kg剂量的rapakinin后,抗高血压活性也被CCK1和IP拮抗剂阻断,认为rapakinin的抗高血压活性主要由CCK1和IP受体依赖性的血管舒张诱导。
发酵食品主要是发酵乳制品和传统发酵食品,发酵乳制品主要是利用乳酸菌发酵。Anne Pihlanto等[25]研究了25种乳酸杆菌发酵牛奶的体外ACE抑制活性,其中Lactobacillus jensenii发酵的牛奶对SHR有短暂的降血压作用。1995年,Nakamura以Lactobacillus Helveticus和Saccharomyces Cerovisiae菌株作为乳发酵剂制成Calpis酸乳,并且通过四步HLPC从Calpis酸乳中纯化了VPP和IPP两种ACE抑制肽[26]。
传统发酵食品也是ACE抑制肽的一个研究方向,如Okamoto等对11种发酵食品(鱼酱、日本酱油、日本清酒、日本豆酱、醋、奶酪、干鱼、日本味噌、纳豆、豆腐乳和丹贝),结果发现日本豆酱、鱼酱、纳豆、豆腐乳及一些奶酪有比较强的ACE抑制活性,而日本酱油(一般酿造方式酿造)、苹果醋、乡村奶酪和大米味噌没有或几乎没有抑制活性[7]。戴军等[27]利用基体辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱分析和液相色谱-电喷雾电离四极杆-飞行时间串联质谱联用分析鉴定出黄酒中4种ACE活性抑制肽的氨基酸序列为:VEDGGV、PST、NT和LY。
ACE抑制肽必须完整地进入循环系统才能在人体内发挥功能,但通常肽会被消化道酶,黏膜、细胞质或血清相关肽酶水解。目前多应用人结肠腺癌细胞(the humancolon adenocarcinoma cell lines,Caco-2细胞)模型研究记录体外ACE抑制肽的肠道吸收,因为人们普遍承认,这种细胞是用来预测药品的肠上皮细胞渗透的合理模型[1,28]。Foltz M等[29]对牛奶ACE抑制肽IPP和VPP进行体外渗透性研究,发现两种肽很容易通过肠道上皮细胞运输,并且IPP可避免肠胃消化而完整地进入人体循环系统。研究口服富含IPP和VPP的食物,已经证明这样的食物对高血压患者表现出降血压的作用[28]。这清楚地表明,某些ACE抑制肽被人体吸收充分能有效地降低高血压患者的血压。现在,研究人员所面临的挑战是如何使在体外具有生物活性的肽能够完整地进入循环系统,并且在它们的催化位点仍然具有活性。
人体内ACE有三种异构体,它们是同一个基因的不同剪接产物。异构体1在各种组织中普遍存在,称为体细胞ACE(somaticACE,sACE),含有1306个氨基酸残基。异构体2和异构体3在睾丸组织和成熟的精子细胞中表达,称为睾丸ACE(testic ACE,tACE),分别含有732个氨基酸残基和739个氨基酸残基。sACE分子量为149.723ku,由N端信号肽(第l~30个氨基酸)、两个同源的催化活性中心(N-催化结构域和C-催化结构域)、亲脂跨膜区(第1257~1276个氨基酸)和细胞内结构域组成。膜外侧第1232个氨基酸残基处存在一个金属分泌酶的酶切位点,酶切后失去C末端的ACE分泌进人血浆,成为可溶状态,称为血浆型ACE。与sACE不同的是,tACE只含有单个催化活性中心,其中异构体2分子量为80.073ku,N端信号肽为(1~31氨基酸),除了信号肽与N端稍有差异,从第68个氨基酸残基开始,其氨基酸序列与sACE完全相同。异构体3分子量为83.989ku,N端序列与异构体2完全相同,但从第657个氨基酸开始由于移码突变使得C端有差异[30]。
ACE抑制肽常含有2~20个氨基酸,但是也已鉴定出>20个氨基酸的活性肽[28]。ACE抑制肽活性与其氨基酸组成和氨基酸序列具有重要关系;但关于ACE抑制肽构效关系至今尚未完全清楚。国内外学者普遍认为,ACE抑制肽活性与其自身特性有关[1,28]。sACE的C端催化部位包括三个子催化位点:S’、S1’和S2’,这三个位点分别与血管紧张素ⅠC-末端的三个疏水性残基Phe-His-Leu相对应[31]。研究发现C端氨基酸与ACE抑制肽的抑制活性有重要关系,C端为芳香族氨基酸和脯氨酸时其抑制活性较高。据报道,在倒数第二的位置,脂肪族(V,I,A),碱性(R)和芳香族(Y和F)氨基酸残基是首选,而芳香族(W,Y和F)、脯氨酸(P)和脂肪族(A,L和M)残基在肽C-末端的最终位置倍受青睐[28]。而且,C端残基上带正电荷的氨基酸,如赖氨酸(ε-氨基)和精氨酸(胍基),可以显著提高降压肽的抑制活性[1,28],ACE抑制肽的另一个共同特点是N-末端疏水性[32],对于大于3个氨基酸长度的多肽,已认为羟脯氨酸(Hyp)的存在是肽与ACE催化位点结合的关键[33]。此外,肽的整体疏水性很重要,亲水性肽具有弱的或没有ACE抑制活性,因为亲水性肽与ACE的活性部位是不相容的。事实上,ACE抑制作用是通过疏水性多肽与ACE子催化位点的高亲和力来实现的[28]。
ACE抑制肽的作用不仅仅与C端三个氨基酸残基有关,切割位点的N端残基可能与ACE的关键子催化点相互作用[34]。如Kohmura等[35]发现N-端延伸可以增加抑制效力,他发现N端添加氨基酸后IC50值下降,[IC50值:IYP (61μmol),LIYP(10μmol),PLIYP(4.4μmol);HLPLP(41μmol),LHLPLP(2.9μmol)]。肽的立体结构对其活性也有影响。C-末端残基为脯氨酸时(该氨基酸具刚性环状结构),它可能将羧基构象锁定,有利于酶活性位点的正电荷残基相互作用[36]。研究表明,含有trans-Pro构象的肽,与含cis-Pro的肽相比是更好的ACE底物[37]。Gomez-Ruiz等[38]发现在含trans-Pro构象的β-酪蛋白f(47-51)肽DKIHP有较高的ACE抑制剂活性。抑制肽结构及其与活性中心的相互作用可导致活性的差异,trans-Pro到cis-Pro的改变会导致抑制肽的羰基换位到肽链的相反面,使肽失去了其原有的与酶相连的氢键,损失了与活性位点的相互作用,并反过来使结合酶的能力和抑制活性的下降。
目前已有用分子对接的方法来研究降血压肽与ACE的结合作用。分子对接方法(Molecular Docking Method)已成为药物设计方法中比较成熟的直接药物设计方法。从已知结构的受体(靶蛋白或活性位点)和配体出发,通过化学计量学方法模拟分子的几何结构和分子间作用力来进行分子间相互作用识别并预测受体与配体复合物结构的方法称为分子对接。分子对接的常用软件有:DOCK,AUTODOCK,SYBYL,Program Sievgene,Arguslab等。目前分子对接技术已被广泛应用于研究ACE抑制肽与ACE的结合作用[11],WANG等[39]用分子对接技术获得了肽链(KVLILA)与ACE结合的合理的结构模型。Pan等[11]认为肽与ACE最佳结合形式的牢固性与肽结合ACE残基的氢键、疏水相互作用、亲水性及静电相互作用有关。
由于ACE抑制肽的氨基酸组成和结构差别很大,且食品蛋白酶解的产物成分相当复杂,大大增加了分离纯化的难度。目前分离提取肽的方法主要有超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、凝胶层析法、离子交换层析法、反相高效液相色谱法等[40]。Jang等[41]用超滤、Sephadex G-25柱层析和反相高效液相色谱联用,从姬蘑的水提取物中分离纯化得到两种ACE抑制肽,IC50值分别为0.46、1.14mg/mL。Hasan等[15]从模拟人工胃液消化鲣鱼肉的样品中分离活性肽,先用反相PC-IACE亲和柱分离,洗脱得到的组分再经COSMOSIL 5C18-MS-II制备色谱柱,洗脱峰在215nm用光电二极管阵列检测器(SPD-6AV)检测。
ACE抑制肽活性检测方法主要有体内和体外两种。很多研究发现降血压肽的体内外活性存在较大的差异[1,28],认为体内分析对于验证肽的生理活性影响是必不可少的。此外,理论上的蛋白酶的特异性和体外消化实验不能用于安全预测生物活性肽在胃肠消化中的情况,因为水解度可能会由于肽链长度、肽的性质以及介质中的其他肽的种类不同而有所不同。短链多肽在肠胃过程可得到保留,而长链活性多肽当以口服方式在机体发挥其生理效应时,需要避免胃肠道酶的水解[1]。
目前体外检测方法主要有三种:a.紫外分光光度法:Cushman和Cheung[42]建立了紫外分光光度法测定ACE抑制剂的活性。该方法是利用ACE在37℃,pH8.3条件下催化分解马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸,通过测定有无抑制剂时,生成的马尿酸在228nm处的紫外吸收差值得到其抑制活性,用IC50值表示。后续虽然也有学者对此方法进行了修改[43],但该方法操作步骤较繁琐,分析时间较长,对实验操作要求甚高,易产生误差。b.高效液相色谱法(HPLC):徐蓉蓉等[44]采用HPLC建立一套新的快速测定方法,使HHL与生成的马尿酸得到良好的分离,同时采用双波长(228nm和215nm)检测法以防止其他物质如酶提取物中的小肽、杂质等干扰马尿酸的测定。该方法免去了改良Cushman和Cheung法[43]的繁琐步骤,简便、快速,具有良好的重复性。c.可见分光光度法:该方法的原理为。
FAPGG为淡黄色复合物,在345nm处有一吸收峰,与ACE作用后水解生成无色的FAP,使得在345nm吸收光度下降,通过光吸收减弱程度评价ACE抑制肽活性[8,45]。此外,高丹丹等[46]根据Gaffney纸层析法显色原理提出了改进的分光光度计法,其依据是马尿酸在乙酸酐中能与含对二甲氨基苯甲醛的吡啶溶液发生显色反应,生成桔黄色化合物。在一定浓度范围内,其颜色深浅与马尿酸含量成正比,可以通过计算马尿酸的生成量来计算ACE的抑制率。与传统测定方法相比,该方法更加灵敏准确且重复性好。
一般使用原发性高血压大白鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR)来评价降血压肽的生物学效应,通过测量大白鼠摄入ACE抑制剂前后动脉收缩压变化情况来判断抑制功效的好坏。也可对大白鼠静脉注射六甲铵(降压药),以除去与肾素-血管紧张素无关的调节系统的影响,再依次静脉注射ACE抑制剂和AngI,大鼠血压变化量的大小体现了ACE抑制肽的活性大小[8,47]。但是,由于体内实验费用昂贵、操作复杂、实验周期长等缺点,其应用受到一定的限制,在筛选ACE抑制肽的过程中可以先采用体外检测法选出活性强的组分,再进行体内检测来确定其功效。
目前国内外对食源性ACE抑制肽的研究已经有很多,特别是乳源蛋白和鱼蛋白来源的ACE抑制肽,但对其产量方面关注较少。近几年来,工业化生产方面也仅仅是开发其作为保健食品或其添加物使用,如日本卫生福利部批准的特定保健用食品——鲣鱼干的嗜热菌蛋白酶酶解物(称为“katsuobushi oligopeptide”)[4],以及乳制品Calpis®(日本)和Evolus®芬兰)[28],而真正作为药物生产的很少见。因此加强对ACE抑制肽构效关系的深入研究及临床实验,为降血压肽药物的生产提供依据是迫在眉睫要解决的问题。
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Research progress in food-derived angiotensin converting enzyme inhibitory peptides
DUAN Xiu,ZHANG Yu-feng,ZHUANG Yong-liang*
(Research Centre of Food Engineering,College of Chemistry and Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)
TS201.1
A
1002-0306(2012)20-0388-06
2012-05-22 *通讯联系人
段秀(1990-),女,硕士研究生,研究方向:功能食品。
国家自然科学基金项目(31101392)。