纳豆激酶对角叉菜胶所致小鼠血栓模型的影响

刘彦霞，陈 文，温宗妍，赵肖萌

（北京联合大学应用文理学院，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191）

纳豆激酶对角叉菜胶所致小鼠血栓模型的影响

刘彦霞，陈 文，温宗妍，赵肖萌

（北京联合大学应用文理学院，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191）

目的：观察纳豆激酶对角叉菜胶所致的小鼠血栓模型的影响，为纳豆激酶相关产品的溶血栓功能性评价提供依据。方法：将雌性昆明种小鼠随机分为4组：空白组、模型对照组、低剂量组、高剂量组。连续灌胃30d，每天一次，于第30d，除空白组外，其他3组均用角叉菜胶制备尾部血栓模型，24h后观察并测量黑尾长度，之后摘眼球取血，测定血清纤维蛋白降解产物（FDP）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、组织型纤溶酶原激活剂抑制剂1（PAI-1）的含量。结果：各组小鼠最后一次称重体重无显著性差异；低剂量组与高剂量组的出栓率低于模型对照组，但模型对照组、低剂量组、高剂量组三组间相比较，黑尾长度、黑尾/全尾长的无显著性差异（p＞0.05）；高剂量组小鼠血清中的FDP及t-PA的含量显著高于模型对照组和低剂量组（p＜0.05）；空白组未检出PAI-1，其余各组PAI-1的含量无显著性差异。结论：纳豆激酶对实验小鼠体内血栓具有溶解作用，可以降低血栓的发生率；角叉菜胶诱导的小鼠血栓模型可以用于纳豆激酶溶（抗）血栓功能评价。

纳豆激酶，角叉菜胶，小鼠，尾部血栓

Abstract：Objective：Observed effect of nattokinase on the tail-thrombus model，and provided basis for the function evaluation of nattokinase product.Methods：The mice were randomly allocated into four groups（each group with 12 mice），including the normal group，the model control group，the low-dose nattokinase group，and the high-dose nattokinase group.Weighing up the mice was done every 7d.After the mice were fed for 30d，except for the normal group，other 3 groups were used to establish tail-thrombus models with carrageenan.After models were established for 24h，we observed the length of dark tails，and then detected the Fibrinogen degradation product（FDP），tissue type plasminogen activator（t-PA），and tissue type plasminogen activator inhibitor（PAI-1） in serum.Results：There was no significant difference between the length of dark tails among the model control group，the low-dose nattokinase group and the high-dose nattokinase group（p＞0.05），but the dark tail rates of the later two group were lower than the former one.The values of FDP and t-PA of the high-dose nattokinase group were higher than those of the model control group and the low-dose nattokinase group（p＜0.05）.no PAI-1 was detected in the normal，and other groups had similar values of PAI-1.Conclusions：Nattokinase was effective in dissolving blood clots，and dropping incidence of disease.Carrageenan induced tail-thrombus model could be used to evaluate the antithrombotic and fibrinolysis enhancing effects of nattokinase.

Key words：nattokinase；carrageenan；mice；tail-thrombus

血栓栓塞性疾病是目前严重危害中老年人健康的疾病，其发病率高，致残致死率高。要减轻这一疾病的危害，重点在于预防。纳豆是日本的一种传统大豆发酵食品，由蒸煮后的大豆接入枯草芽孢杆菌发酵而成。纳豆激酶（NK）是一种由纳豆菌或纳豆产生的碱性丝氨酸蛋白酶[1]，具有溶栓作用，与现有的溶栓剂如尿激酶、链激酶相比，在体内半衰期长，能温和持续地提高血液的纤溶活性，同时不易引起出血[2]，因而受到生物医学与食品界的广泛关注[2-6]。所以市场上出现了多种纳豆激酶保健食品，且都口头宣称自己的产品具有良好的溶栓效果。然而，与之相对应的纳豆激酶溶栓活性的检测方法却发展相对滞后，卫生部2003年《保健食品检验与评价技术规范》中没有抗血栓或溶血栓的功能声称。因此无法对市场中宣传具有溶血栓功能的相关产品进行有效监管。角叉菜胶诱导鼠科动物尾部血栓模型制备方法简单，对实验操作人员技术要求不高，在适宜的环境条件下可以实现较高的造模成功率。造模过程不需要杀害动物，对动物的伤害相对较小。因为血栓出现在尾部，而且血栓的程度易于观察和测量，适合对血栓形成过程的动态观察[7-8]。另外，该模型对象是实验室小动物，所需费用较少。基于这些优点，该动物模型已经在食品的抗血栓功能评价方面得到较为广泛的应用[9-13]。如戎冬梅等[9]对比了饮酒对小鼠尾部血栓形成的影响，各组小鼠于造模后12～48h测量小鼠黑尾长度，结果发现高剂量白酒组的小鼠比模型对照组及低剂量白酒组中小鼠的体重低，黑尾也明显增长，表明随着酒量的加大，血栓形成的危险增加。缪红等[12]采用角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓模型研究黄岑中黄酮类物质对血栓形成的影响。实验组动物灌胃不同剂量的受试物，对照组灌胃等体积蒸馏水，于第5d给受试物1h后制备模型，之后24～72h观察动物黑尾发生率及黑尾长度，结果表明黄芩茎叶明显降低了小鼠黑尾发生率。本研究旨在利用角叉菜胶所致小鼠尾部血栓模型，观察纳豆激酶对角叉菜胶所致血栓形成的影响以及其溶栓机制，为纳豆激酶相关产品的抗血栓功能性评价方法的制定提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

实验动物 SPF级健康雌性昆明种小鼠48只，体重约28g左右，购于北京华阜康生物科技有限公司（许可证号SCXK-（京）2009-0007），饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室（许可证号SYXK-（京）2007-0020）；角叉菜胶C1013-25G，Type I，Sigma公司，批次#021M0038V；ELISA试剂盒（FDP、t-PA、PAI） 武汉华美生物工程有限公司；纳豆激酶 样品活力350mg=5000FU，浙江中奇生物药业股份有限公司。

游标卡尺，BioTek酶标仪ELx808，Sartorius BS233S分析天平，Anke TDL-5型离心机，恒温培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组与处理 将48只小鼠常规喂养一周后随机分为4组：空白组、模型对照组、低剂量组、高剂量组，各12只。各组均采用灌胃途径，按100μL/10g·bw的灌胃量给药，喂食30d，其中每7d称重1次。

表1 分组及其处理方式Table 1 Groups and the treatments

1.2.2 小鼠血栓模型的制备 于第30d开始造模，精密称取角叉菜胶，以生理盐水配成0.2g/100mL的质量浓度；小鼠称重后，采取腹腔注射角叉菜胶，注射剂量为100μL/10g·bw。造模后将小鼠置于（17±2）℃的环境饲养，自由饮食。

1.2.3 小鼠尾部血栓形成长度的测定 因在预实验中发现，48h时小鼠尾部血栓部位已经开始部分脱落，其黑尾长度已经没有意义，所以选择在造模24h后，以游标卡尺测量小鼠尾长及黑尾长度。然后，各组小鼠被摘除眼球取血，分离血清，分装于洁净离心管中，-20℃冰箱冷藏备用。

1.2.4 小鼠纤溶功能指标的测定 根据ELISA试剂盒操作说明方法测定血清FDP、t-PA、PAI。测试前将试剂盒和血清置于室温中至少平衡30min。

ELISA标准曲线通过“Curve Exert1.3”软件绘制。

2 结果与讨论

2.1 纳豆激酶对小鼠体重的影响

由表2可以看出，在30d灌胃期间，各组平均体重一直处于增长状态中。其中，低剂量组与高剂量组体重增长相近，均略低于空白组与模型对照组。

在实验前分组时，各组小鼠间体重无差异（p＞0.05）。经过了30d蒸馏水或纳豆激酶灌胃后，各组动物的体重都明显的增加了（p＜0.05）。在最后一次测量体重时，灌胃纳豆激酶的小鼠体重与空白组、模型对照组的体重没有显著性差异（p＞0.05），说明纳豆激酶不会影响小鼠的正常生长。

表2 实验前后小鼠体重的变化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

表2 实验前后小鼠体重的变化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

注：*表示同一组动物实验前后体重相比较，有显著性差异（p＜0.05）。

灌胃第30d造模前体重（g）空白组 27.50±1.53 36.60±2.30*模型对照组 28.06±1.14 36.88±2.19*纳豆激酶低剂量组 28.00±0.61 34.95±1.67*纳豆激酶高剂量组 27.94±0.82 35.17±2.22*组别 开始灌胃前体重（g）

2.2 纳豆激酶对小鼠黑尾形成的影响

由表3可知，造模24h后，空白组小鼠黑尾形成率为0，模型对照组黑尾形成率为100%，说明造模成功；低剂量与高剂量组小鼠黑尾形成率均为91.67%，说明灌胃纳豆激酶可以一定程度上降低由角叉菜胶所诱导尾部血栓的形成率。模型对照组、低剂量组、高剂量组黑尾长度、黑尾/全尾长的差异无显著性（p＞0.05），表明灌胃纳豆激酶不能降低所出现血栓的程度。

表3 纳豆激酶对小鼠黑尾形成的影响（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

表3 纳豆激酶对小鼠黑尾形成的影响（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

组别 黑尾长度（cm） 黑尾/全尾长 黑尾形成率（%）空白组 0 0 0模型对照组 3.42±1.66 0.33±0.16 100%低剂量组 3.38±2.34 0.33±0.23 91.67%高剂量组 3.49±1.91 0.34±0.19 91.67%

2.3 纳豆激酶对小鼠体内纤溶功能的影响

表4中为纳豆激酶对小鼠纤溶系统功能几项指标的影响，如表4所示，模型对照组及纳豆激酶低、高剂量组中FDP的含量均比空白组显著增加（p＜0.05）。FDP是综合反映纤溶亢进的指标，既包括纤溶酶降解纤维蛋白之后的产物（FDP），也包括降解纤维蛋白原之后的产物（FiDP）。模型对照组小鼠血清中的FDP含量显著高于空白组（p＜0.05），说明血栓造模后小鼠体内自身的纤溶系统启动，所生成的纤维蛋白原降解产物增多；高剂量组显著高于模型对照组（p＜0.05），表明高剂量的纳豆激酶能够增强小鼠纤溶系统的功能；而低剂量组与模型空白的FDP值之间没有显著性差异（p＞0.05），低剂量纳豆激酶没有起到增强小鼠纤溶系统功能的作用；高剂量组小鼠血清中的FDP含量显著高于低剂量组（p＜0.05），表明纳豆激酶增强小鼠纤溶系统活性的能力存在量效关系。

表4 纳豆激酶对小鼠纤溶系统功能指标的影响（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

表4 纳豆激酶对小鼠纤溶系统功能指标的影响（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

注：nd：表示没有未检出；*表示与空白组相比较有显著性差异（p＜0.05）；▲表示与模型对照组及低剂量组相比较有显著性差异（p＜0.05）。

组别 FDP（μg/L） t-PA（μg/L） PAI-1（μg/L）空白组 7.03±2.44 1.78±0.25 nd模型对照组 12.28±3.16* 23.25±1.84* 3.33±0.98低剂量组 10.84±4.46* 24.62±3.07* 3.22±1.12高剂量组 16.12±2.17*▲ 30.11±4.24*▲ 2.87±0.52

t-PA与PAI-1分别是组织型纤溶酶原激活剂与抑制剂。在正常情况下，纤溶酶以酶原的形式存在，只有在t-PA的作用下，才能转化为有活性的纤溶酶。PAI在纤溶过程中起着重要作用，PAI-1是t-PA主要的抑制剂，二者含量的变化对血浆促凝和抗凝的功能状态有影响。如表4所示，造模后各处理组小鼠血清t-PA值都显著高于空白组（p＜0.05）；同时高剂量组中t-PA含量明显高于模型对照组与低剂量组（p＜0.05），说明喂食高剂量纳豆激酶可以显著增加小鼠血清t-PA的含量，且存在一定的量效关系。空白组中没有检测出PAI-1，因为小鼠在正常状态t-PA与PAI-1保持一定的比例关系，在前者含量很低的情况下，后者的含量也很低，所以没有检测到PAI-1。而其他各组中均检测出含有PAI-1，高剂量组中PAI-1的值较模型对照组及低剂量组低，但各组之间不存在显著性差异（p＞0.05），表明喂食纳豆激酶对PAI-1的含量没有明显影响。

3 讨论

自从1987年日本的Sumi H等人发现纳豆中存在可以溶解血栓纤维蛋白的成分-纳豆激酶以后[14]，已经有很多学者对纳豆激酶的结构、药理学以及药效等方面进行了研究，发现其具有多方面保健作用，但其纤溶作用比较突出，该方面的研究居多。

段智变等[15]通过20%FeCl3制备兔颈动脉血栓模型，并利用日本大耳兔观察纳豆激酶粗酶液的体内溶血栓作用，结果发现，高剂量组给药2h后，FDP含量明显增高；张利[16]用电刺激血栓形成法给药后制备大鼠颈动脉血栓模型，观察从血栓形成到动脉血流完全阻断所需要的时间，对纳豆激酶溶血栓作进行研究，发现纳豆激酶均能显著地延长血流阻断所需的时间；实验同时还利用日本大耳兔为实验动物，采用股动脉富含红细胞血栓模型，研究了纳豆激酶对兔股动脉栓塞的再通作用，结果发现空白对照组无一侧股动脉再通，而给予纳豆激酶后约40min，兔股动脉平均血流量恢复50%以上，FDP检测结果明显增高，表明纳豆激酶具有较强的体内溶栓作用；在对其溶栓机理进行研究时发现，纳豆激酶可显著提高t-PA的含量及活性，而对PAI-1的含量无明显影响，表明纳豆激酶可以通过激活t-PA来发挥溶栓作用的，这与本实验研究结果相同。毛娜娜[17]利用肾上腺素加冰浴制备大鼠急性血瘀模型，并通过Real Time PCR观察纳豆激酶对大鼠主动脉t-PA、PAI-1基因表达的影响，发现纳豆激酶可明显增加t-PA mRNA的表达，但对PAI-1 mRNA的表达无明显性影响。

本实验中采用小鼠作为实验动物，利用简单的动物模型对纳豆激酶的纤溶活性进行了研究。在研究纳豆激酶对黑尾形成率的影响时发现，灌胃一定剂量的纳豆激酶可以起到降低黑尾发生率也即血栓发病率的作用。同时，对其纤溶机制进行研究的结果表明，喂食高剂量的纳豆激酶能够提高t-PA的值，对PAI-1没有显著影响，FDP含量有显著增加。

4 结论

纳豆激酶对实验小鼠体内血栓具有溶解作用从而起到预防血栓发生的效果，能够降低血栓的发病率；角叉菜胶诱导的小鼠血栓模型可以用于纳豆激酶溶（抗）血栓功能评价，通过黑尾的发生率进行初步判断，同时对其纤溶功能的生化指标如FDP、t-PA、PAI-1的检测值进行进一步确认。

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Impact of nattokinase on carrageenan induced tail-thrombus mice

LIU Yan-xia，CHEN Wen，WEN Zong-yan，ZHAO Xiao-meng
（Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods，College of Arts and Science，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）20-0330-04

2012－07－19

刘彦霞（1976－），女，博士，助理研究员，研究方向：保健食品功能评价研究。

北京市教委科技计划面上项目（KM201211417005）；北京联合大学人才强校计划人才资助项目。