果糖基转移酶的固定化及其性质研究

姚盟成，杨丽萍，司建华，荆 玮，路福平，李 玉，*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津市工业微生物重点实验室，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457；2.云南健生生物科技有限公司，云南昆明 650217）

果糖基转移酶的固定化及其性质研究

姚盟成1，杨丽萍2，司建华2，荆 玮1，路福平1，李 玉1，*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津市工业微生物重点实验室，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457；2.云南健生生物科技有限公司，云南昆明 650217）

果糖基转移酶的固定化可以很方便地实现酶的回收和再利用。以HPA25L树脂为固定化载体，对果糖基转移酶进行了固定化初步研究。结果表明，其最优固定化条件为：采用先交联后固定化方法，以戊二醛为交联剂，固定化温度20℃，pH5.0，加酶量10mL/g树脂，戊二醛浓度为0.15%，得到固定化酶酶活达120U/g，酶活回收率达81%，其最适反应温度和pH分别为55℃和7.0，利用固定化酶连续反应12个批次后，酶活仍然保留达20%以上。

果糖基转移酶，固定化酶，低聚果糖，HPA25L树脂

Abstract：To recycle easily and reuse fructosyltransferase for producing fructooligosacchari-des with its excellent catalytic properties，fructosyltransferase was immobilized on resin of HPA25L.The optimum operation parameter was examined，and the optimum conditions for the immobilization were obtained as follows：glutaraldehyde 0.15%，temperature 20℃，pH5.0 and fructosyltransferase 10mL/g（resin）.Under these conditions，the total recovery percentage of the immobilized enzyme specific activity was above 81%.And the optimum operation pH and temperature of immobilized enzyme were 55℃ and 7.0 respectively.After 12 times reused，the activity of immobilized enzyme retained more than 20%.

Key words：fructosyltransferase；immobilization enzyme；fructooligosaccharides；resin of HPA 25L

低聚果糖（Fructooligosaccharides，简称FOS），又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n=1～3（G为葡萄糖，F为果糖）。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通过β-1-2糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体：蔗果三糖（1-kestose，GF2）、蔗果四糖（nystose，GF3）、蔗果五糖（1F-fructofuranosyl nystose，GF4）及其混合物[1]。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌；低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖还具有可促进矿物质的吸收、增强身体的免疫功能、抗癌、降血糖以及防龋齿等功能[2-3]。低聚果糖广泛的存在于大麦、西红柿、黑麦等植物当中，但其含量较少，低于1%，开发较难。而利用微生物的低聚果糖生产酶果糖基转移酶却可以得到高纯度、高产量的低聚果糖。果糖基转移酶（fructosyltransferase，EC2.4.1.9），是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖而得到蔗果三糖等低聚糖。因此，人们越来越关注果糖基转移酶及低聚果糖生产，目前国内利用果糖基转移酶生产低聚果糖一般采用游离酶直接作用于蔗糖，此法有游离酶只能利用一次、生产成本高、产物收率不高等缺点，而固定化酶与游离酶相比，固定化酶极易与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化，能够在较长时间内进行反应（分批反应和连续反应），便于实现连续化和自动化，能够提高酶的稳定性和利用率，生产成本降低；还可以增加产物的收率，提高产物的质量[4-5]。因此果糖基转移酶的固定化已经逐渐成为研究热点，已报道的果糖基转移酶的固定化载体有大孔阴离子树脂、壳聚糖、羟磷灰石等[6-8]。三菱化学阴离子交换树脂HPA25L是一种高多孔型阴离子交换树脂，是一类既不溶于水也不熔于有机溶剂、且具有三维空间网状骨架结构亲水性的功能高分子材料。利用连接在树脂骨架上的功能基团与酶作用，可将酶固定在树脂上，构成固定化酶，且其价格低廉、机械强度好、物化性能稳定，容易再生，耐膨胀收缩力强，是一种较为理想的固定化酶载体。本实验采用高多孔型三菱化学阴离子交换树脂（HPA25L）为载体，对其固定化条件及其性质进行了相关研究，为果糖基转移酶的固定化研究和低聚果糖生产提供了理论依据，具有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉菌丝体 云南健生生物科技公司；阴离子交换树脂HPA25L 上海三菱化学商贸有限公司；戊二醛 中国医药（集团）上海化学试剂公司。

Agilent1200液相色谱系统 美国Agilent公司；WE-3恒温水浴振荡器 天津欧诺仪器仪表有限公司；DW3冷冻干燥机 丹麦Heto公司；高速冷冻离心机 Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理 称取10g树脂在10%NaCl溶液中浸泡1h（质量体积比为1∶5），然后用蒸馏水将树脂清洗干净，再用同样5倍体积的蒸馏水浸泡10h。将树脂置于5倍体积的1mol/L NaOH溶液中1～2h，并不时搅拌，然后用蒸馏水洗涤树脂，水洗至中性，再置于5倍体积的1mol/L HCl溶液中1～2h，不时搅拌，然后水洗至中性，重复“碱-水-酸-水”三个循环，最后将树脂置于0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液中4℃保存备用[9-10]。

1.2.2 游离果糖基转移酶的提取 在黑曲霉菌丝中加入5倍体积的水，球磨机5000r/min条件下20min，球磨两次，然后在超高压均质机1000bar条件下破壁两次，冷冻离心，超滤浓缩得到粗酶液，再冷冻干燥至粉末，放置4℃冰箱长期保存备用。

1.2.3 固定化方法

1.2.3.1 先交联后固定 称取适量的树脂，将其置于5倍体积的0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液中，加入适量50%戊二醛，交联作用8h，之后用蒸馏水清洗三次，洗去多余戊二醛。

将处理好的酶液相对树脂按5倍体积的量加入反应容器中，固定化作用18h，之后用蒸馏水清洗三次，分别测定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.3.2 交联与固定同步 称取适量的树脂，将其置于5倍体积的酶液中，加入适量50%戊二醛，置于恒温条件下作用24h，之后用蒸馏水清洗三次，分别测定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.3.3 先固定后交联 称取适量的树脂，将其置于5倍体积的酶液中，反应18h，之后分别用蒸馏水清洗三次，洗去多余游离酶。然后加入适量50%戊二醛，交联8h，之后用蒸馏水清洗三次，洗去多余的戊二醛，分别测定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.4 果糖基转移酶的酶活测定 取16mL 12.5%的蔗糖溶液和4mL pH5.0的0.05mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液倒入三角瓶中。加入适量游离酶液或者固定化酶，在50℃温度下，200r/min的恒温回旋式摇床中反应60min，取出后于沸水浴中煮沸10min终止反应，冷至室温，于10000r/min台式离心机上离心2min，取上层清液，作为HPLC法测定蔗果三糖含量的试液，并计算出酶活及相对酶活。

1.2.5 果糖基转移酶的酶活定义 果糖基转移酶酶活定义为：在上述反应条件下，每1min产生1μmol GF2所需的酶量为1个活力单位，固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法[11]。固定化酶活回收率：固定化酶活与所添加的游离酶总酶活的比值。

1.2.6 固定化酶酶学性质研究

1.2.6.1 固定化酶酶的最适反应温度和pH 分别将固定化酶和游离酶保存在40、45、50、55、60、65、70℃温度下1h，然后分别测定其酶活，计算其相对酶活；分别将固定化酶和游离酶保存在pH为4、5、6、7、8缓冲液中1h，然后分别测定其酶活，计算其相对酶活。

1.2.6.2 固定化酶酶的操作稳定 利用固定化酶转化50%的蔗糖生成低聚果糖，低聚果糖的含量达到50%以上算一个批次，每反应一个批次测一次残余酶活，然后再重新加入底物，进行下一批次反应。

2 结果与分析

2.1 固定化条件优化

2.1.1 不同固定化方法对酶的固定化的影响 本实验先后采取了先交联后固定、交联固定同步以及先固定后交联的方式进行固定化研究，固定化温度4℃，戊二醛浓度为0.1%，固定化pH为6.0，加酶量为5倍体积的条件下，交联6h，固定12h，交联固定同步进行固定化6h。其结果如表1所示，酶活分别是95、80.5、10.3U/g，酶活回收率分别为75%、63.5%、8.1%。结果表明，先加交联剂戊二醛后固定化的效果最好，固定化酶活95U/g最高，酶活回收率75%也最高。所以我们将采取先交联后固定的方式进行果糖基转移酶的固定化。

表1 不同固定化方法对固定化的影响Table 1 Effect of method of immobilization on activity of immobilized enzyme

2.1.2 不同温度对酶的固定化的影响 采用先交联后固定的固定化方法，在戊二醛浓度为0.1%、pH为6.0、加酶量为5倍体积的条件下，研究不同的温度对酶的固定化的影响，其结果如图1所示，低温有利于酶的稳定，但是吸附交联需要一定的温度。4～20℃温度下，随着温度的上升，固定化效果有一定提高，但到了20℃时，固定化酶活有了较大辐度的下降，温度越高不利于酶的稳定，因此酶的固定化最适温度为20℃。

图1 不同温度对固定化的影响Fig.1 Effect of temperature on activity of immobilized enzyme

2.1.3 不同pH对酶的固定化的影响 采用先交联后固定的固定化方法，在戊二醛浓度为0.1%、固定化温度20℃、加酶量为5倍体积的条件下，选用不同pH条件下进行酶的固定化研究。pH对酶的稳定性具有十分重要的影响，pH过高或者过低都对酶的稳定产生较大的影响，图2表明，酶固定化的最适pH是5.0，在此条件下，酶的稳定性好，有利于游离酶的吸附交联，从而有利于游离酶的固定化，因而其最适固定化pH为5.0。

图2 不同pH对固定化的影响Fig.2 Effect of pH on activity of immobilized enzyme

2.1.4 不同加酶量对酶的固定化的影响 采用先交联后固定的固定化方法，在戊二醛浓度为0.1%、固定化温度20℃、固定化pH5.0的条件下，研究不同的加酶量对酶固定化的影响，其结果如图3所示。随着酶液量加大，固定化酶活逐渐升高，但是其酶活损失却相对增加，即酶活回收率降低，这是由于在离子交换树脂的活性基团未被酶交联饱和前，固定化酶活将随着加酶量的增加而增强，在活性基团被酶交联饱和后，固定化酶的活力不再随加酶量的增加而明显增加，甚至当加酶量达到一定程度时，会因为结合的酶分子过多而造成酶作用的空间位阻加大，使酶活性增加缓慢，酶活损失加大。因此，综合考虑固定化酶活和酶活损失，最适加酶量为10倍体积（每1g树脂加10mL体积酶液）。

图3 不同酶量对固定化的影响Fig.3 Effect of amount of enzyme on activity of immobilized enzyme

2.1.5 戊二醛的浓度对酶的固定化的影响 采用先交联后固定的固定化方法，在加酶量为10倍体积、固定化温度20℃、固定化pH5.0的条件下，研究不同浓度的戊二醛对酶的固定化的影响，其结果如图4所示。戊二醛是一种交联剂，但也是一种使酶变性的试剂。在一定浓度范围内，提高戊二醛浓度可以提高固定化效果，但是超过一定浓度时，戊二醛将会使酶变性失活，影响固定化酶的效果，实验结果表明：戊二醛浓度小于0.15%时候，固定化酶活随着戊二醛浓度增加而增加，当戊二醛浓度大于0.15%后，固定化酶活将会降低，说明当戊二醛浓度是0.15%时，固定化效果最好，因此，戊二醛浓度为0.15%是固定化交联剂的最适浓度。此时利用最优条件得到固定化酶酶活达120U/g，此次所用初始酶液酶活为148.1U/mL，酶活回收率达81%。

图4 不同戊二醛浓度对固定化的影响Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on activity of immobilized enzyme

2.2 固定化酶酶学性质

2.2.1 固定化酶的最适pH和最适反应温度 由图5可以看出，游离酶的最适温度为50℃，而固定化酶的最适温度为55℃。因此果糖基转移酶固定化后最适温度升高，并且在70℃时，游离酶没有酶活，而固定化酶酶活达60%以上，这可能是由于载体的保护作用，使酶在固定化后对热变性作用不敏感，热稳定性增加。由图6可以看出，游离酶和固定化酶的最适反应pH分别为6.0和7.0，这是由于吸附、交联等作用，固定化材料大孔阴离子树脂与酶蛋白基团上的化学键发生了作用，影响到了酶的活性部位，从而使固定化酶的最适反应pH增加了一个单位。

图5 固定化酶和游离酶的最适反应温度Fig.5 Optimum temperature of immobilized and soluble enzyme

图6 固定化酶和游离酶的最适反应pHFig.6 Optimum pH of immobilized and soluble enzyme

2.2.2 固定化酶的操作稳定性 利用固定化酶催化蔗糖转化为50%以上纯度的低聚果糖，结果如图7所示，固定化酶连续反应12个批次后，固定化酶酶活仍然保持20%以上，说明固定化酶具有较好的操作稳定性。而马玉红利用D380作为固定化载体固定果糖基转移酶重复使用10次后残余酶活仅为10%左右[12]。

图7 固定化酶的操作稳定性Fig.7 Operation stability of immobilized enzyme

3 结论

以HPA25L为载体进行果糖基转移酶的固定化，其最优条件是：加酶量为10倍体积于树脂（酶液体积与树脂的质量之比），在20℃、pH5.0的条件下先交联后固定，加酶量10mL/g树脂以浓度为0.15%的戊二醛为交联剂，获得的果糖基转移酶固定化酶，其酶活120U/g，酶活回收率为81%，固定化酶最适反应温度和pH分别为55℃和7.0。利用固定化酶生产低聚果糖，连续反应12批次后，固定化酶酶活仍然保持20%以上。利用固定化果糖基转移酶生产低聚果糖，是低聚果糖工业化大规模生产的一个突破点，具有十分巨大的工业应用价值。

[1]Cheng T C， Duan K J， Sheu D C.Immobilization of betafructofuranosidase from Aspergillus japonicus on chitosan using tris（hydroxymethyl） phosphine or glutaraldehyde as a coupling agent[J].Biotechnol Lett，2005，27（5）：335-338.

[2]Yun J W.Fructooligosaccharides-Ocuurence，preparation，and application[J].Enzyme and Microbial Technology，1996，（19）：107-117.

[3]Sangeetha P T，Ramesh M N，Prapulla S G.Recent trends in the microbial production，analysis and application of Fructooligosaccharides[J].Trends in Food Science&Technology，2005，16（10）：442-457.

[4]Wiesbauer， J.Bolivar， Juan M.Mueller， et al.Oriented Immobilization of Enzymes Made Fit for Applied Biocatalysis：Non-Covalent Attachment to Anionic Supports using Zbasic2 Module[J].Chem Cat Chem，2011，3（8）：1299-1303.

[5]雷生姣，潘思轶，肖敏，等.MCM-41固定化柚苷酶脱苦葡萄柚汁[J].食品工业科技，2012，33（1）：189-193.

[6]Alvarado H， Mónica B， Maugeri F， et al.Kinetics and modeling of fructo-oligosaccharide synthesis by immobilized fructosyltransferase from Rhodotorula sp.[J].Journal of Chemical Technology&Biotechnology，2010，85（12）：1654-1662.

[7]张艳，江波，陈超.离子交换树脂固定果糖基转移酶[J].无锡轻工大学学报，2004，4（23）：60-64.

[8]魏远安，谢庆武，姚评佳，等.固定化果糖基转移酶的理化性质及稳定性研究[J].广西大学学报：自然科学版，2002，27（1）：1-4.

[9]马玲芝，钱俊青.离子交换树脂固定化脂肪酶催化合成蔗糖乙酯[J].浙江工业大学学报，2012，40（1）：21-24.

[10]陈卿，蔡国林，蔡国林.树脂固定化α-乙酰乳酸脱羧酶的初步研究[J].食品工业科技，2012，32（2）：154-15 8.

[11]Alfredo Eduardo Maiorano， Rosane Moniz Piccoli， Elda Sabino da Silva，et al.Microbial production of fructosyltransferases for synthesis of pre-biotics[J].Biotechnol Lett，2008，30（11）：1867-1877.

[12]马玉红，翁桂华，张涛，等.阴离子交换树脂固定化果糖基转移酶的研究[J].食品工业科技，2010，31（2）：174-177.

Research of preparation and properties of immobilized fructosyltransferase

YAO Meng-cheng1，YANG Li-ping2，SI Jian-hua2，JING Wei1，LU Fu-ping1，LI Yu1，*
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Yunnan Jiansheng Biological Technology Co.，Ltd.，Kunming 650217，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0164-04

2012-04-05 *通讯联系人

姚盟成（1987-），男，在读硕士，研究方向：酶工程。

“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011AA100905-4）；天津市科技计划项目（10ZCKFNC01700）；长江学者和创新团队发展计划资助（IRT1166）。