ADAM23在小鼠脑组织的表达①

康 静 毛会丽 闫 欣 刘 瑞 林俊堂 丰慧根 (新乡医学院生命科学技术系，新乡453003)

ADAM，是一类去整合素和金属蛋白水解酶家族(A disintegrin and metalloprotease，ADAM)的英文缩写［1］。ADAM由相互独立但又互补的功能域所构成，包含8个结构域，自N-端至C-端依次为:信号肽、前体结构域、金属蛋白酶域、去整合素域、富含Cys结构域、表皮生长因子结合域，跨膜域和胞质域(图1)［2］，它们在脊椎动物发育过程中，特别是中枢神经系统，扮演重要的角色［3-8］。

图1 ADAM功能形态模型Fig.1 The ADAM function model

相对于其它 ADAM家族成员，ADAM11、ADAM22和ADAM23这3个基因序列的同源性更高，并且主要在脑中表达，因而被归入一个“脑MDC(Metalloprotease/Disintegrin/Cysteine-rich)”亚类［9］。从表达分布来看，ADAM11、ADAM22和ADAM23可能与小脑内运动神经元回路的建立有关［10-12］。ADAM23最初由Sagane等［9］通过基因克隆的方法获得。Northern blot结果表明:人ADAM23主要在脑组织中表达，在心脏中有弱表达，其它组织中的表达量都低于检测下限，而且主要由神经细胞表达［12］。Goldsmith［13］运用原位杂交的方法证实了ADAM23在大鼠海马结构和小脑都有很高的表达量。另外，缺失了ADAM23的幼鼠在出生一周后出现了神经发育缺陷，并在不久后死亡［10］。但是，ADAM23在成年小鼠(Mouse)脑的各个组织的表达情况仍然未知。本实验应用原位杂交方法系统分析ADAM23在成年小鼠脑内的表达分布情况，为探讨ADAM23在脊椎动物中枢神经系统发育过程中的作用提供形态学依据。

1 材料与方法

1．1 材料 实验动物与分组:健康雄性昆明种小鼠20只，体重18～22克，由新乡医学院实验动物中心提供。其中10只小鼠用于原位杂交检测，10只用于RT-PCR检测。

1．2 方法

1．2．1 总RNA的抽提 取10只小鼠断头处死，冰盘上快速取脑，用高温处理过的锡箔纸包裹，液氮中速冻后－80℃冰箱保存待测。小鼠脑组织RNA提取:按 Ishimitsu 等［14］建立的“异硫氰酸胍-酚-氯仿”方法，从小鼠左侧额顶叶、海马、丘脑、侧脑室组织提取脑组织总RNA，采用紫外线吸收法进行RNA定量，各组RNA样品的纯度OD 260nm/OD 280nm比值均在1．8 ～2．0 之间。

1．2．2 RT-PCR及探针制备 将 RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增ADAM。引物序列:Upper primer:5'-CTCCCGGAAAGGCGGAAAGAGCAGA G-3';Lower primer:5'-GTGGCATTCCTCCAGTGCAG ACGATTCA-3');扩增条件:95℃ 5分钟;95℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃ 30秒，30循环;72℃ 5分钟。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带后连接到PCRII-TOPO载体中，DNA测序获知cDNA插入方向，用于RNA探针制备。根据德国Roche公司地高辛标记RNA探针合成试剂盒说明，参考序列合成结果，限制性剪切酶BamHⅠ消化TOPOII-ADAM23质粒成线性，然后用T7 RNA polymerase合成含有地高辛标记的反义 RNA探针，纯化后进行杂交实验。

1．2．3 原位杂交方法 本实验采用的原位杂交方法系在Redies［15］的方法定位和相对定量显示mRNA阳性组织和细胞。

取10只动物开胸经左心室插管至升主动脉，肝素生理盐水冲洗血液后，用4%的多聚甲醛灌注，断头取脑，置于4%的多聚甲醛固定液中固定4小时，后常规冰冻切片，取两耳及连线前6 mm左右冠状切面，切片厚20 μm，－80℃冰箱保存备用。

冰冻切片50℃干燥1小时，4% 多聚甲醛4℃固定30分钟，PBS洗涤2次，每次5分钟，蛋白酶K消化5分钟，然后PBS洗涤5分钟，4%多聚甲醛4℃再次固定30分钟，用DEPC处理过的去离子水洗涤5分钟后，再用三乙醇胺-乙酸酐溶液处理20分钟，PBS洗涤2次后(每次5分钟)分别加处理过的ADAM23 RNA探针(杂交液A和杂交液B混合)，并用硅化干烤过的盖玻片覆盖载玻片后放入加有原位杂交平衡液的湿盒中，70℃杂交过夜。

70℃过夜杂交后，在5×SSC中去除盖玻片，载玻片在5×SSC中室温放置10分钟，然后5×SSC 60℃洗涤30分钟，接着50%(v/v)甲酰胺加2×SSC 60℃洗涤1小时，1×NTE 37℃清洗三次，每次10分钟，RNA酶溶液37℃消化30分钟后，1×NTE 37℃洗片10分钟，再次50%(v/v)甲酰胺加2×SSC 60℃洗涤40分钟，2×SSC 60℃洗涤30分钟，0．1×SSC室温洗涤30分钟，紧接着PBS洗涤2次，每次5分钟。使用0．1%(v/v)绵羊血清封闭30分钟后加1∶2 500碱性磷酸酶标记地高辛抗体4℃过夜孵育。

次日TBS洗涤3次，每次20分钟，用Tris碱-NaCl缓冲液(pH9．5)洗涤10分钟，每张载玻片加包含NBT和BCIP的原位杂交显色液1 ml，室温或4℃下避光显色，视信号强弱终止显色，充分水洗，脱水，透明，封片，显微镜观察。

2 结果

2．1 RT-PCR及探针制备结果 通过RT-PCR，我们获得了大小为2．4 kb的片段(图2)，胶回收后连接PCRII-TOPO载体中获得的阳性克隆经测序后与NCBI基因库进行比对后发现同源性极高。原位杂交结果显示自制的反义探针信号强，背景低，利于结果分析。

2．2 ADAM23同源性分析 从NCBI基因库中得到了大鼠、鸡及人类的ADAM23 ORF阅读框序列，通过MEAG4软件绘制了进化树(图3)来描述小鼠的ADAM23与其他种类ADAM23的同源性关系。结果显示:小鼠ADAM23与大鼠的ADAM23同源性最高;与鸡的ADAM23同源性次之;与人类的ADAM23同源性最低。

2．3 ADAM23在小鼠脑组织的表达 光镜下染色反应产物呈蓝紫色，主要见于细胞浆，轴突有少量表达。在小鼠脑内ADAM23 mRNA染色阳性细胞主要表达在大脑皮层、尾状壳核、海马CA3区锥体细胞、齿状回的锥细胞、小脑、下丘的中央核、小脑核侧部、小脑核前部、前庭外侧核区、下丘脑后核、乳头体内侧核、前庭内侧核、舌下神经核、脑桥、延髓区域等(图4、5)，图4、5中英文缩写对照见表1。图4A显示前脑中大脑皮层、尾状壳核、海马区域的表达;图4B和C显示图4A方框区域的放大，图4B显示大脑皮层颗粒层的表达;图4C显示海马CA3区域的表达，可见浦肯野细胞层高表达;图4D显示小脑、下丘的中央核、小脑核侧部、小脑核前部、前庭外侧核区域的表达;图4E和F显示图4D方框区域的放大，图E显示小脑区域的浦肯野细胞层的高表达;图F显示前庭外侧核区域的高表达;图G显示下丘脑区域的表达;图H和I是图4G方框区域的放大，可见丘脑束旁核、杏仁核内侧的腹后部、未定带区域的高表达。图5A显示脑桥区域中的前庭神经核 、前庭内侧核的高表达;图5B和C显示图5A方框区域的放大;图5D显示延脑区域的表达;图E和F显示图D方框区域的放大，可见舌下神经核、网状核区域神经元的细胞浆蓝紫色着色。其中海马的CA1和CA3区、齿状回的锥细胞、小脑的普肯野细胞层和粒细胞层为高表达区域，其次为前庭外侧核区、下丘脑后核、乳头体内侧核。ADAM23在海马CA3区和小脑中，普肯野细胞层高表达(图4C、E中箭头所指部分)，颗粒细胞层和分子层中也表达这个蛋白，但表达量相对低很多(图4A和图4B)。下丘脑区域中的舌下神经核、网状核也出现高表达(图5E、F中箭头所指部分)，我们还观察了中枢神经系统的其他部分，结果显示ADAM23在中枢神经系统中广泛表达。

图2 小鼠脑ADAM23 RT-RCR结果Fig.2 RT-PCR of mouse ADAM23

图3 小鼠、大鼠、鸡和人类ADAM23进化树Fig.3 The four ADAM23 evolutionary relationship

表1 图4、5中英文缩写的中英文对照Tab．1 Abbreviations used in the figure 4 and 5

3 讨论

ADAM家族成员具有复杂的功能，从已有的结果来看，ADAM23是ADAM家族的去整合素结构域中的一种细胞表面粘附分子，参与了细胞-细胞及细胞-基质的相互作用，从而影响细胞的迁移，ADAM23在细胞的分化、神经纤维聚集成束、轴突的形成和分叉具有极强的影响力，参与各种生理及病理过程，包括受精、神经发生、肌细胞发生、细胞因子和生长因子的加工、细胞迁移、炎症反应和肿瘤形成等［16，17］。本研究结果表明，ADAM23 广泛分布于脑的不同部分，而在海马结构、小脑中的浦肯野细胞和基底神经节则具有非常强的表达。这些部位在运动的反馈调节中有重要作用;从表达分布来看，ADAM23可能与大脑皮层、小脑内运动神经元回路的建立有关，小脑主要与大脑皮层的联合活动和运动计划的形成以及运动程序的编制有关，皮层内各种神经元细胞间有错综复杂的联系，ADAM23极有可能通过不同的整合素或其他配体整合，使各种神经元之间建立联系。这与 Goldsmith等［13］人的研究一致。

ADAM23高表达的部分都是神经纤维密集的部分，纹状体是基底核的一个部分，基底核参与对随意运动的调节，和中枢神经系统各个部分有广泛的纤维联系;海马体由海马通路的纤维向外侧集中而形成;小脑主要协调骨骼肌的运动，维持和调节肌肉的紧张，保持身体的平衡;脑干是维持个体生命特征，包括心跳、呼吸、消化、体温、睡眠等重要生理功能，ADAM23在这些部位的高表达说明，ADAM23除了分布于神经细胞胞体，还可能通过胞浆运输到轴突、树突中发挥功能;ADAM23在不同神经元突起的分布有差异，提示ADAM23可能在突起进一步分化成轴突、树突等过程中发挥作用;上述形态特征和文献报道的结果吻合［12，13］。

本课题组尽管对其生物学特性、产物特性和在神经发育过程中的作用进行了研究，但进一步弄清其详细的作用机制、作用途径和其他生物学功能以及其在神经发育阶段所扮演的角色，将是今后所要解决的问题。

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