日本柳杉花粉变应原CJP-6的重组表达和免疫反应性鉴定①

蒋建国 刘瑞玲 付永锋 程训佳 (复旦大学上海医学院病原生物学系，上海200032)

花粉症是一种严重影响人类健康的过敏反应性疾病。在日本，日本柳杉(Cryptomeria japonica)花粉是春季空气中的主要变应原，吸入飘散在空气中的花粉会引起花粉特异性的IgE产生，导致过敏性鼻炎、过敏性哮喘等过敏反应性疾病［1］，而日本柳杉在我国不同地区的园林中也有大量栽培。

日本柳杉花粉中含有多种变应原蛋白，目前有两种变应原研究的比较详细透彻，已被国际免疫学会变应原命名分会官方认定为主要的变应原，一种是具有果胶酶活性的Cry j 1，一种是具有聚甲基半乳糖醛酶活性的Cry j 2［2］。CJP-6是在日本柳杉花粉中被发现的第3种主要变应原，属于异黄酮还原酶家族，由306个氨基酸组成，具有很高的IgE结合活性和免疫原性［3］。目前，国内临床主要使用花粉浸提液对花粉症患者进行诊断和脱敏治疗，但浸提液的组分非常复杂，容易引起诊断的假阳性和过敏反应，且难以标准化［4］。利用基因工程技术制备日本柳杉花粉变应原CJP-6，有助于诊断与治疗试剂的标准化，促进日本柳杉花粉过敏反应性疾病的诊断与治疗研究。

本研究通过RT-PCR获得上海地区日本柳杉花粉的cDNA，从中克隆和表达了cjp-6基因，并通过Dot blot和ELISA方法检测其与过敏病人血清中IgE的反应性，为过敏性疾病的临床诊断和治疗奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 本实验所采用的植物材料是上海地区日本柳杉花粉，采摘后于－80℃保存。

1．1．2 菌株和载体 原核表达载体pET-19b购自美国Novagen公司，大肠杆菌JM109感受态细胞购自大连 TaKaRa公司，E．coli BL21 Star(DE3)pLysS购自美国Invitrogen公司。

1．1．3 主要实验材料 Rneasy Total RNA Kit购自德国Qiagen公司，GeneAmp RNA PCR Kit购自美国Perkin-Elmer公司，His结合树脂购自 Novagen公司，Taq 酶、100 bp ladder Markers、λHind Ⅲ DNA Markers、DNA连接酶、限制性内切酶 XhoⅠ和BamHⅠ等购自大连TaKaRa公司。引物合成和测序由上海Invitrogen公司完成。本研究所用60份日本柳杉花粉过敏病人的血清由日本东京大学附属病院提供，血清由UniCAP检测证实了其反应性，而且UniCAP检测值在三级以上;60份尘螨过敏患者的血清和60份蒿草过敏患者的血清由天津医科大学总医院的变态反应科提供，UniCAP检测值在三级以上。

1．2 方法

1．2．1 总 RNA的提取和 cDNA的获取 按照Rneasy Total RNA试剂盒的使用说明，提取日本柳杉的总RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit进行RTPCR，获得 cDNA。

1．2．2 引物设计 根据GeneBank公布的CJP-6变应原(AY028631)mRNA序列设计引物，并加入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点和保护性碱基。正向引物为5'-CCCTCGAGATGGGAGGAAGTAGGGTT-3'，反向引物为5'-CCGGATCCTCATACAAATGCACTG-3'。

1．2．3 重组表达质粒的构建 以cDNA为模板，PCR扩增编码cjp-6的基因片段;将纯化的PCR产物以XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，插入pET-19b表达载体中，转入大肠杆菌JM109，将菌液涂布于LB琼脂板(含氨苄青霉素 50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)，37℃过夜培养后，提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。

1．2．4 重组日本柳杉变应原CJP-6的表达 重组质粒pET19b-CJP6转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS后，涂布于LB琼脂板，37℃温箱中培养过夜。挑选单一菌落入1 600 ml LB培养液(含氨苄青霉素50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)中，37℃ 220 r/min 振摇，培养至 OD600约为0．5时，加入1 mmol/L的IPTG，37℃诱导3小时，4℃ 8 000 r/min离心10分钟，弃上清，收集细菌沉淀。将沉淀超声后取其少量，12．5%SDS-PAGE 电泳，观察结果。

1．2．5 重组日本柳杉变应原CJP-6的纯化 参照Novagen公司的His Binding kit使用说明，用His结合树脂纯化蛋白，纯化蛋白以12．5%的SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，DC Protein Assay试剂盒检测重组蛋白含量，4℃冰箱保存。

1．2．6 Dot blot检测 参照 Tachibana 等［5］的方法进行Dot blot检测。将重组日本柳杉变应原CJP-6蛋白加样于硝酸纤维素膜上，室温干燥后，以含3%牛血清白蛋白的PBS湿盒内室温封闭1小时;加入日本柳杉过敏病人血清(1∶5稀释)，4℃孵育过夜;加入HRP goat Anti-Human IgE 抗体(1∶250稀释)，室温孵育1小时;以DAB显色，20分钟后终止反应。

1．2．7 ELISA检测 参照已有文献［6］稍作修改进行，重组变应原以0．05 mol/L、pH9．6的碳酸盐缓冲液稀释至 1 μg/ml，每孔用 0．1 ml包被酶标板，4℃过夜;日本柳杉、尘螨与蒿草过敏患者血清和正常人血清(1∶5稀释)4℃孵育过夜;HRP goat Anti-human IgE抗体室温孵育1小时;最终用OPD显色，反应30分钟终止反应。

2 结果

2．1 cjp-6基因的扩增 用RNA提取试剂盒提取日本柳杉花粉的总RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit进行RT-PCR，获得cDNA。以cDNA为模板，用引物通过PCR反应扩增出CJP-6蛋白编码基因，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在900 bp左右处有明显条带，大小与理论值(921 bp)相符(图1)。

图1 cjp-6基因PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳分析Fig．1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of cjp-6 gene

图2 cjp-6核苷酸序列同源性比较Fig．2 Comparison of nucleotide sequence between cjp-6 with AY028631

图3 重组变应原CJP-6的SDS-PAGE分析图Fig．3 SDS-PAGE analysis of the recombinant CJP-6 protein

2．2 重组表达载体的构建与序列分析 表达载体pET19b-CJP-6经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，电泳结果表明目标条带与cjp-6基因片段的PCR产物大小一致，说明成功构建了日本柳杉花粉变应原CJP-6的重组质粒pET19b-CJP-6。对重组质粒进行测序鉴定，采用 Vector NTI 10软件和 GENETYX-MAC Ver13软件系统推定氨基酸序列，并与GenBank中公布的序列(AY028631)进行比对。CJP-6仅有1个核苷酸位点与AY028631不同(图2)，而无氨基酸残基的改变。

图4 重组变应原CJP-6的Dot blot鉴定Fig．4 Dot blot analysis of CJP-6 protein

2．3 重组蛋白CJP-6的表达与纯化 以重组质粒pET19b-CJP-6转化E．coli BL21 Star(DE3)pLysS，挑取转化子培养，用IPTG诱导表达3小时，菌体经超声破碎后，进行SDS-PAGE分析，结果显示在Mr约为36 kD处有明显蛋白表达条带(图4)，与预测分子量36．7 kD相符。重组蛋白主要以可溶性形式表达，经His结合树脂纯化后纯度可达到95%以上(图3)。使用DC Protein Assay试剂盒检测重组蛋白含量，最终结果表明每升培养液的细菌可制备50 mg日本柳杉CJP-6变应原重组蛋白。

2．4 Dot blot检测 重组CJP-6可与日本柳杉花粉过敏病人血清中的IgE发生特异性结合，而与正常人血清中的IgE不反应(图4)。

2．5 ELISA检测 重组CJP-6与日本柳杉花粉过敏患者血液中的IgE有良好的结合活性，具有免疫原性和免疫反应性，其中有32个患者血清与重组CJP-6反应呈阳性，阳性率为53．3%(图5)。为了解CJP-6与中国过敏性疾病患者，尤其是尘螨和蒿草过敏患者的血清反应性，进行ELISA检测其与IgE的反应性，重组变应原CJP-6与尘螨过敏患者血清反应阳性率为45%，与蒿草花粉过敏患者血清反应阳性率为51．6%，其反应性的平均值与日本柳杉花粉过敏的患者血清相似(图6)。

3 讨论

花粉过敏性疾病是一种严重危害人类健康的常见病，由日本柳杉花粉引起的过敏性哮喘是日本最严重的过敏性疾病，在春季日本柳杉花粉会诱发20%以上的日本人出现过敏性哮喘［2，7］。日本柳杉作为重要的绿化树种，在中国很多地区都有种植，日本柳杉花粉过敏原有可能成为中国过敏性疾病潜在的过敏原，应引起我们重视。而目前，尚未有对日本柳杉花粉过敏性疾病的标准化诊断与脱敏治疗试剂，国内临床上主要使用花粉浸提液对花粉症患者进行诊断和脱敏治疗，但花粉浸提液成分很多，影响诊断与治疗的准确性与疗效。利用DNA重组技术制备花粉中的主要变应原，具有成分单一、操作简单的优点，将为过敏反应性疾病的诊断与治疗起重要作用。

日本柳杉花粉含有很多种变应原，除公认的Cry j 1和Cry j 2两种主要变应原外，CJP-6是在其提取物中发现的第三种主要变应原，是一种异黄酮还原酶，与同属于异黄酮还原酶家族的其他变应原序列同源性很高。本研究在国内首次成功克隆了日本柳杉的cjp-6基因，并成功在原核表达系统中进行表达。本研究中采用的表达载体是pET19b，该表达系统为高表达系统，其产量可达到每升细菌纯化50 mg重组变应原CJP-6，同时其所表达的重组蛋白N端带有组氨酸标签，便于蛋白的纯化。实验结果表明，通过Ni2+亲和层析就可以得到纯度很高的CJP-6蛋白，为CJP-6生物制剂的开发奠定了基础。

本研究中，重组变应原CJP-6与日本柳杉花粉过敏病人血清反应的Dot blot结果表明重组变应原具有很高的IgE结合活性和免疫原性，可作为对日本柳杉花粉过敏患者进行诊断和特异性免疫治疗的候选分子。Kawamoto等［3］报道，以 Western blot检测15位日本柳杉过敏性患者血清有10位患者与重组变应原CJP-6反应，血清阳性率为67%。而我们以ELISA检测了60位日本柳杉过敏病人的血清，其中32份血清中的IgE与重组变应原CJP-6的反应，其阳性率为53．3%。重组变应原CJP-6与日本柳杉花粉过敏患者反应阳性率的差异，可能是由于不同的检测方法所导致。另外，值得注意的是，CJP-6与中国过敏性疾病患者血清反应的ELISA检测结果表明，尘螨或者蒿草过敏病人血清与重组变应原CJP-6的IgE阳性率很高，分别为45%和51．6%，且反应性平均值与日本柳杉花粉过敏的患者血清相似。这些结果说明，尘螨变应原和蒿草花粉变应原与日本柳杉花粉变应原CJP-6存在着交叉反应性，这可能是由于花粉变应原与尘螨或者蒿草花粉中的变应原在氨基酸序列、蛋白质空间结构或者蛋白质功能等方面具有较大的相似性［8，9］。因而，免疫治疗螨类吸入性过敏的制剂是否可以用来治疗花粉过敏患者，重组CJP-6是否可以用于治疗其他变应原过敏患者，从而达到异病同治的目的，还需要做进一步深入的研究。

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